超氧陰離子清除能力試劑盒說明書
微量法100T/96S
注 意:正式測定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。
測定意義:
超氧陰離子自由基作為生物體代謝過程中產(chǎn)生的一種自由基,可攻擊生物大分子,如脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、核酸和聚不飽和脂肪酸等,使其交鏈或者斷裂,引起細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的破壞,與機(jī)體衰老和病變有很密切的關(guān)系,清除超氧陰離子自由基的研究已經(jīng)得到了廣泛的關(guān)注。
測定原理:
AP-TEMED系統(tǒng)產(chǎn)生超氧陰離子,與鹽酸羥胺反應(yīng)生成NO2-,NO2-與對氨基苯磺酸和α-萘胺的作用生成紅色的偶氮化合物,在530nm處有特征吸收峰,樣品對超氧陰離子的清除能力與530nm的吸光值呈負(fù)相關(guān)。
自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器:
天平、研缽、低溫離心機(jī)、可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板、恒溫水浴鍋。
試劑組成和配制:
提取液:液體100mL×1瓶,4℃保存。
試劑一:液體1.5mL×1支,4℃避光保存。
試劑二:粉劑×1瓶,4℃避光保存。臨用前加6mL蒸餾水充分溶解。
試劑三:液體7.5mL×1瓶,4℃保存。
試劑四:液體7.5mL×1瓶,4℃避光保存。
試劑五:液體7.5mL×1瓶,4℃避光保存。
樣品處理
1. 組織:按照質(zhì)量(g):提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g,加入1mL提取液)加入提取液,冰浴勻漿后于4℃,10000g離心10min,取上清置于冰上待測。
2. 細(xì)胞:按照細(xì)胞數(shù)量(104個(gè)):提取液體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬細(xì)胞加入1mL提取液),冰浴超聲波破碎細(xì)胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時(shí)間3min);然后4℃,10000g離心10min,取上清置于冰上待測。
3. 培養(yǎng)液或其它液體:直接檢測。
4. 粉劑藥物可配制成相同濃度,比如1mg/mL。
測定操作
對照管 | 測定管 | |
試劑一(μL) | 10 | 10 |
試劑二(μL) | 40 | 40 |
H2O(μL) | 25 | |
充分混勻,25℃反應(yīng)1min | ||
樣品(μL) | 25 | |
試劑三(μL) | 50 | 50 |
充分混勻,37℃反應(yīng)30min | ||
試劑四(μL) | 50 | 50 |
試劑五(μL) | 50 | 50 |
充分混勻,37℃顯色20min,于微量石英比色皿/96孔板,在530nm處測定對照管和測定管的吸光值,分別記為A對照管和A測定管。 |
注意:對照管只需測定一次。
計(jì)算公式:
超氧陰離子清除率 I%=
注意事項(xiàng):
1. 試劑一4℃可保存2個(gè)月,配制好的試劑二4℃可保存一周,建議實(shí)驗(yàn)前配制,并盡快使用。
2. 樣品處理完后立即進(jìn)行測定,或者低溫保存不超過24小時(shí)。
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