單寧含量試劑盒說(shuō)明書
微量法100管/96樣
注 意 :正式測(cè)定前取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定
測(cè)定意義:
單寧是一類廣泛存在于植物體內(nèi)的多元酚化合物,又稱植物多酚。具有du特的化學(xué)性質(zhì)和多種生理活性,如能與蛋白質(zhì)、生物堿、多糖結(jié)合;能與多種金屬離子發(fā)生絡(luò)合或靜電作用;具有止血、抑制微生物、抗過敏、抗突變、抗腫瘤、抗衰老等生理活性。
測(cè)定原理:
單寧在堿性環(huán)境下與磷鉬酸反應(yīng),生成藍(lán)色化合物,在760nm處有最大吸收峰。
需自備的儀器和用品:
可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽和蒸餾水。
試劑的組成和配制:
試劑一:液體4mL× 1瓶,4℃保存;
試劑二:液體3mL × 1瓶,4℃保存;
單寧的提?。?/span>
按照組織質(zhì)量(g):蒸餾水體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL蒸餾水),充分勻漿后轉(zhuǎn)移到EP管中,80℃水浴提取30min, 8000 g,25℃離心10 min,取上清液待測(cè)。
測(cè)定步驟:
1、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至760nm處,蒸餾水調(diào)零;試劑一和試劑二37℃預(yù)熱10min以上;
2、操作表:
試劑名稱(µL) | 對(duì)照管 | 測(cè)定管 |
樣本 | 5 | |
蒸餾水 | 135 | 130 |
試劑一 | 35 | 35 |
混勻,室溫靜置5min
試劑二 | 30 | 30 |
混勻,室溫靜置30min,760nm處讀取吸光值A,ΔA=A測(cè)定-A對(duì)照,對(duì)照管只要做一管。
單寧含量計(jì)算:
a.用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下:
1、標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定的回歸方程為y = 1.6418x +0.0134;x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度(mg/mL),y為ΔA(A測(cè)定-A對(duì)照)。
2、按樣本鮮重計(jì)算:
單寧含量(mg /g鮮重)= [(ΔA-0.0134) ÷1.6418×V1]÷(W×V1÷V2)=0.609×(ΔA-0.0134) ÷W。
3、按樣本蛋白濃度計(jì)算:
單寧含量(mg/mg prot)= [(ΔA-0.0134) ÷1.6418×V1]÷(V1×Cpr)=0.609×(ΔA-0.0134) ÷Cpr。
V1:加入樣本體積,0.005mL;V2:加入提取液體積,1mL; Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本鮮重,g。
b.用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下:
1、標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定的回歸方程為y = 0.8209x+0.0134;x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度(mg/mL),y為ΔA(A測(cè)定-A對(duì)照)。
2、按樣本鮮重計(jì)算:
單寧含量(mg/g鮮重)=[(ΔA-0.0134)÷0.8209×V1]÷(W×V1÷V2)=1.218×(ΔA-0.0134) ÷W。
3、按樣本蛋白濃度計(jì)算:
單寧含量(mg/mg prot)= [(ΔA-0.0134)÷0.8209×V1]÷(V1×Cpr)=1.218×(ΔA-0.0134)÷Cpr。
V1:加入樣本體積,0.005mL;V2:加入提取液體積,1mL; Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本鮮重,g。
注意:
1、 ΔA控制在0.02-0.5范圍內(nèi),若ΔA大于0.5,將樣本提取上清液用蒸餾水稀釋10倍后檢測(cè),計(jì)算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)。
2、 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍為:0.025mg/mL-0.5mg/mL。
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