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超氧陰離子(Oxygen free radical, OFR)試劑盒說明書

發(fā)布時間:2023/11/3      點擊次數(shù):287

超氧陰離子(Oxygen free radical, OFR)試劑盒說明書

                                                   微量法100T/96S

 

 

    意:正式測定之前選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。

測定意義:

生物體內(nèi)超氧陰離子等活性氧具有免疫和信號傳導(dǎo)的作用,但積累過多時會對細(xì)胞膜及生物大分子產(chǎn)生破壞作用,導(dǎo)致機體細(xì)胞和組織代謝異常,從而引起多種疾病。

測定原理:

超氧陰離子與鹽酸羥胺反應(yīng)生成NO2,NO2在對氨基苯磺酸和α-萘胺的作用下,生成紅色的偶氮化合物,在530nm處有特征吸收峰,根據(jù)ΔA值可以計算樣品中O2含量,反應(yīng)式為NH2OH + 2O2 H → NO2 H2O2 H2O

 

自備實驗用品及儀器:

天平、水浴鍋、離心機、可見分光光度計/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板、氯仿和蒸餾水。

 

試劑組成和配制:

提取液:液體110mL×1瓶,4保存。

試劑一:液體20mL×1瓶,4保存。

試劑二:液體15mL×1瓶,4避光保存。

試劑三:液體15mL×1瓶,4避光保存。

試劑四:氯仿,自備。

 

超氧陰離子提取

1.        植物、動物組織:按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)15~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液)進(jìn)行冰浴勻漿,然后,10000g,4℃,離心20min,取上清置于冰上待測。

2.        細(xì)菌、真菌:按照細(xì)胞數(shù)量(104個):提取液體積(mL)為500~10001的比例(建議500萬細(xì)胞加入1mL提取液),冰浴超聲波破碎細(xì)胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時間3min);然后10000g,4℃,離心20min,取上清置于冰上待測。

3.        血清或培養(yǎng)液:直接測定。

 

測定操作表
分光光度計/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min,調(diào)節(jié)波長至530nm。

1、   操作表


空白管

測定管

樣本(μL


200

提取液(μL

200


試劑一(μL)

160

160

混勻,37水浴20min

試劑二(μL

120

120

試劑三(μL

120

120

混勻,37水浴20min

試劑四(μL

200

200

混勻,8000g,25,離心5min,小心吸取上層水相200μL于微量石英比色皿/96孔板中測定A530。ΔA=A測定-A空白,空白管只要做一管。

 

超氧陰離子含量計算公式

a.        用微量石英比色皿測定的計算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)曲線:y = 0.0242x - 0.0027,R2=0.9980

1. 組織:

1)按照樣本質(zhì)量計算

超氧陰離子含量(nmol/g 鮮重)= (ΔA+0.0027)÷0.0242×V反總÷(V÷V樣總×W)×2

                             =148.76×(ΔA+0.0027)÷W

超氧陰離子產(chǎn)生速率(nmol/ g·min=148.76×(ΔA+0.0027)÷W÷T

                                =7.44× (ΔA+0.0027)÷W

2)按照蛋白質(zhì)濃度計算

超氧陰離子含量(nmol/mg prot= (ΔA+0.0027)÷0.0242×V反總÷(V×Cpr)×2

                                             =148.76×(ΔA+0.0027)÷Cpr

超氧陰離子產(chǎn)生速率(nmol/ mg prot·min= 148.76×(ΔA+0.0027)÷Cpr÷T

                                      =7.44× (ΔA+0.0027)÷Cpr

2. 細(xì)菌,真菌:

超氧陰離子含量(nmol/104 cell= (ΔA+0.0027)÷0.0242× V反總÷(V÷V樣總×細(xì)胞數(shù)量)×2

= 148.76×(ΔA+0.0027)÷細(xì)胞數(shù)量

超氧陰離子產(chǎn)生速率(nmol/104 cell·min= 148.76×(ΔA+0.0027)÷細(xì)胞數(shù)量÷T

=7.44× (ΔA+0.0027)÷細(xì)胞數(shù)量

3. 血清或培養(yǎng)液

超氧陰離子 含量(nmol/mL= (ΔA+0.0027)÷0.0242×V反總÷V×2

=148.76× (ΔA+0.0027)

超氧陰離子產(chǎn)生速率(nmol/mL·min= 148.76× (ΔA+0.0027) ÷T

= 7.44× (ΔA+0.0027)

V樣總:加入提取液體積,1 mL V反總:反應(yīng)總體積,0.36mLV樣:反應(yīng)中樣品體積,0.2mL;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣品質(zhì)量,g;T:反應(yīng)時間,20min2: 2分子O2參與反應(yīng)生成1分子NO2。

 

b.96孔板測定的計算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)曲線:y = 0.0121x - 0.0027,R2 = 0.9980

1. 組織:

1)按照樣本質(zhì)量計算

超氧陰離子含量(nmol/g 鮮重)= (ΔA+0.0027)÷0.0121×V反總÷(V÷V樣總×W)×2

                             =297.52× (ΔA+0.0027)÷W

超氧陰離子產(chǎn)生速率(nmol/ g·min=297.52× (ΔA+0.0027)÷W÷T

                                =14.88× (ΔA+0.0027)÷W

2)按照蛋白質(zhì)濃度計算

超氧陰離子含量(nmol/mg prot= (ΔA+0.0027)÷0.0121×V反總÷(V×Cpr)×2

                                            

                                        =297.52× (ΔA+0.0027)÷Cpr

超氧陰離子產(chǎn)生速率(nmol/ mg prot·min= 297.52× (ΔA+0.0027)÷Cpr÷T

                                      =14.88× (ΔA+0.0027)÷Cpr

2. 細(xì)菌,真菌:

超氧陰離子含量(nmol/104 cell=(ΔA+0.0027)÷0.0121× V反總÷(V÷V樣總×細(xì)胞數(shù)量)×2

=297.52× (ΔA+0.0027)÷細(xì)胞數(shù)量

超氧陰離子產(chǎn)生速率(nmol/104 cell·min=297.52× (ΔA+0.0027)÷細(xì)胞數(shù)量÷T

=14.88× (ΔA+0.0027)÷細(xì)胞數(shù)量

3. 血清或培養(yǎng)液

超氧陰離子 含量(nmol/mL=(ΔA+0.0027)÷0.0121 ×V反總÷V×2

=297.52×(ΔA+0.0027)

超氧陰離子產(chǎn)生速率(nmol/mL·min= 297.52×(ΔA+0.0027) ÷T

=14.88×(ΔA+0.0027)

V樣總:加入提取液體積,1 mL; V反總:反應(yīng)總體積,0.36mL;V樣:反應(yīng)中樣品體積,0.2mL;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣品質(zhì)量,gT:反應(yīng)時間,20min;22分子O2參與反應(yīng)生成1分子NO2。

 

注意事項

1、   OD值大于1,樣品適當(dāng)稀釋再測定,注意計算公式里乘以稀釋倍數(shù)。

2、   樣品制備好后,立刻進(jìn)行測定,請勿將樣品進(jìn)行長時間的低溫保存,以免影響測定結(jié)果。

3、   試劑四有一定的毒性,請操作時做好防護(hù)措施。


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