超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase, SOD)試劑盒說(shuō)明書(NBT 法)
微量法 100 管/96 樣
注 意:正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定
測(cè)定意義:
SOD(EC 1.15.1.1)廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中,催化超氧化物陰離子發(fā)生岐化作用,生成 H2O2 和 O2。SOD 不僅是超氧化物陰離子清除酶,也是 H2O2 主要生成酶,在生物抗氧化系統(tǒng)中具有重要作用。
測(cè)定原理:
通過黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)產(chǎn)生超氧陰離子(O2-),O2-可還原氮藍(lán)四唑生成藍(lán)色甲臜,后者在 560nm 處有吸收;SOD 可清除 O2-,從而抑制了甲臜的形成;反應(yīng)液藍(lán)色越深,說(shuō)明 SOD 活性愈低,反之活性越高。
需自備的儀器和用品:
酶標(biāo)儀、離心機(jī)、移液器、96 孔板、研缽、冰和蒸餾水
試劑的組成和配制:
提取液:液體 100mL×1 瓶,4℃保存;
試劑一:液體 5mL×1 瓶,4℃保存;
試劑二:液體 200μL×1 支,4℃保存;
試劑三:液體 4mL×1 瓶,4℃保存;
試劑四:粉劑×2 瓶,4℃保存。
粗酶液提?。?/span>
1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備:
細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞:先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量(104 個(gè)):提取液體積(mL)為 500~1000:1 的比例(建議 500 萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提取液),超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞(冰浴,功率 20%或 200W,超聲 3s,間隔 10s,重復(fù) 30 次);8000g 4℃離心 10min,取上清,置冰上待測(cè)。
組織:按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)為 1:5~10 的比例(建議稱取約 0.1g 組織,加入 1mL 提取液),進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min,取上清,置冰上待測(cè)。
2、血清(漿)樣品:直接檢測(cè)。
測(cè)定步驟:
1、 酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 560nm。
2、 將試劑二用蒸餾水稀釋兩倍,用多少配多少。(試劑二和蒸餾水 1:1 稀釋)
3、 將一瓶試劑四用 5mL 蒸餾水溶解(溶解后一周內(nèi)用完),再用蒸餾水稀釋 4 倍,用多少配多少(試劑四和蒸餾水 1:3 稀釋)。
4、 測(cè)定前將試劑一、三和四在 37℃(哺乳動(dòng)物)或 25℃(其他物種)水浴 5min 以上。
5、樣本測(cè)定(在 EP 管或 96 孔板中依次加入下列試劑)
試劑名稱(μL) | 測(cè)定管 | 對(duì)照管 |
試劑一 | 45 | 45 |
試劑二 | 2 | 2 |
樣本 | 18 | |
蒸餾水 | 18 | |
試劑三 | 35 | 35 |
試劑四 | 100 | 100 |
充分混勻,室溫靜置 30min 后,560nm 處測(cè)定各管吸光值 A。
注意事項(xiàng):
1、試劑二為酶,不可冷凍,使用時(shí)在冰上放置。
2、對(duì)照管只需要做一管。
3、若對(duì)照管吸光值大于 1,建議將試劑二用蒸餾水稀釋 7 倍后使用(10μL 試劑二原液+60μL蒸餾水)。
4、SOD 為什么有的樣本測(cè)定管大于對(duì)照管,對(duì)照管數(shù)值在什么范圍?
對(duì)照管的范圍是 0.4-1。對(duì)照管吸光值過低可能是
(1)試劑二或試劑四沒有現(xiàn)配現(xiàn)用;
(2) 沒有按順序加試劑;
(3)反應(yīng)時(shí)間不夠,可以延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間(反應(yīng)時(shí)間 30min 可以延長(zhǎng)到 40min)。對(duì)照管吸光值過高可能是試劑二未按操作說(shuō)明書稀釋相應(yīng)倍數(shù)。若出現(xiàn)測(cè)定管大于對(duì)照管,可能是樣本中雜質(zhì)的影響太大,為了降低雜質(zhì)的影響一般將樣本提取上清液用蒸餾水或提取液稀釋 10 倍后再測(cè),通??梢允箿y(cè)定正常。計(jì)算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)。
SOD 活性計(jì)算:
1、抑制百分率的計(jì)算
抑制百分率=(A 對(duì)照管-A 測(cè)定管) ÷A 對(duì)照管× 100%
盡量使樣本的抑制百分率在 10-90%范圍內(nèi)。如果計(jì)算出來(lái)的抑制百分率小于 10%或大于90%,則通常需要調(diào)整加樣量后重新測(cè)定。如果測(cè)定出來(lái)的抑制百分率偏高,則需將樣本用提取液適當(dāng)稀釋;如果測(cè)定出來(lái)的抑制百分率偏低,則需重新準(zhǔn)備濃度比較高的待測(cè)樣本。
2、SOD 酶活性單位:
在上述黃嘌呤氧化酶藕聯(lián)反應(yīng)體系中抑制百分率為 50%時(shí),反應(yīng)體系中的 SOD 酶活力定義為一個(gè)酶活力單位(U/mL)。
3、SOD 酶活性計(jì)算:
(1)血清(漿)SOD 活性(U/mL)=[抑制百分率÷(1-抑制百分率)×V 反總]÷V 樣
=11.11×抑制百分率÷(1-抑制百分率)
(2)組織、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞
SOD 活力計(jì)算:
a.按樣本蛋白濃度計(jì)算
SOD 活性(U/mg prot)=[抑制百分率÷(1-抑制百分率)×V 反總]÷(V 樣×Cpr)
=11.11×抑制百分率÷(1-抑制百分率)÷Cpr需要另外測(cè)定,建議使用本公司 BCA 蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒。
b.按樣本鮮重計(jì)算
SOD 活性(U/g 鮮重)=[抑制百分率÷(1-抑制百分率)×V 反總]÷(W ×V 樣÷V 樣總) =11.11×抑制百分率÷(1-抑制百分率)÷W
c.按細(xì)菌或細(xì)胞個(gè)數(shù)計(jì)算
SOD 活力(U/104 cell)=[抑制百分率÷(1-抑制百分率) ×V 反總]÷(500×V 樣÷V 樣總)
=0.022×抑制百分率÷(1-抑制百分率)
V反總:反應(yīng)體系總體積,0.2mL;V 樣:加入反應(yīng)體系中樣本體積,0.018mL;
V 樣總:加入提取液體積,1 mL;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL ;W:樣本質(zhì)量,g;500:細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù),500 萬(wàn)。
電話
微信掃一掃