ATP含量試劑盒說(shuō)明書(shū)
微量法100管/48樣
注 意:正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定
測(cè)定意義:
ATP廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中,是生物能量通貨,能荷是描述細(xì)胞能量代謝狀態(tài)的主要參數(shù)。測(cè)定ATP含量并且計(jì)算能荷,能夠反映能量代謝狀態(tài)。
測(cè)定原理:
肌酸激酶催化肌酸和ATP反應(yīng)生成磷酸肌酸,可在700nm下用磷鉬酸比色法檢測(cè)磷酸肌酸含量,以此反應(yīng)ATP含量。
自備儀器和用品:
分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、水浴鍋、可調(diào)式移液槍、微量石英比色皿/96孔板、研缽和蒸餾水。
試劑組成和配制:
酸性提取液:液體60mL×1瓶,4℃保存;
堿性提取液:液體60mL×1瓶,4℃保存;
試劑一:粉劑×1支,4℃保存;臨用前加入1mL蒸餾水充分溶解待用;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復(fù)凍融。
試劑二:液體1.5mL×1支,4℃保存;
試劑三:粉劑×1瓶,4℃保存;臨用前加入500μL蒸餾水充分溶解待用;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復(fù)凍融。
試劑四:液體5mL×1瓶,4℃保存;
試劑五:液體25mL×1瓶,4℃保存;
標(biāo)準(zhǔn)液:液體10mL×1瓶,2μmol/mLATP標(biāo)準(zhǔn)液,4℃保存;
ATP提取:
1、血清(漿)中ATP的提取:按照血清(漿)體積(mL):酸性提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議取約0.1mL血清(漿),加入1mL酸性提取液),進(jìn)行冰浴勻漿,8000g 4 ℃離心10min;取上清液至另一EP管中,加入等體積的堿性提取液使之中和,混勻,8000g 4 ℃離心10min,取上清,置冰上待測(cè)(不可用于蛋白質(zhì)含量測(cè)定)。
2、組織中ATP的提取:按照組織質(zhì)量(g):酸性提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL酸性提取液),進(jìn)行冰浴勻漿,8000g 4℃離心10min,取上清至另一EP管中,加入等體積的堿性提取液使之中和,混勻,8000g 4 ℃離心10min,取上清,置冰上待測(cè)(不可用于蛋白質(zhì)含量測(cè)定)。
3、細(xì)胞或細(xì)菌中ATP的提取:先收集細(xì)胞或細(xì)菌到離心管內(nèi),棄上清,按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量(104個(gè)):酸性提取液體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL酸性提取液),超聲波破碎1min(冰浴,強(qiáng)度20%或200W,超聲2s,停1s),8000g 4 ℃離心10min;取上清液至另一EP管中,加入等體積的堿性提取液使之中和,混勻,8000g 4 ℃離心10min,取上清,置冰上待測(cè)(不可用于蛋白質(zhì)含量測(cè)定)。
測(cè)定步驟:
1、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30 min以上,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到700nm,蒸餾水調(diào)零。
2、顯色劑的配制:臨用前請(qǐng)根據(jù)擬用顯色劑體積(樣本數(shù)×0.2 m L),按試劑四(mL):試劑五(mL)=1:5的比例配制。用多少配多少。
3、樣本測(cè)定:
試劑名稱(μL) | 測(cè)定管 | 對(duì)照管 | 標(biāo)準(zhǔn)管 | 空白管 |
樣本 | 10 | 10 | ||
標(biāo)準(zhǔn)液 | 10 | 10 | ||
試劑一 | 20 | 20 | ||
試劑二 | 10 | 10 | 10 | 10 |
試劑三 | 10 | 10 | ||
蒸餾水 | 30 | 30 |
充分混勻,37℃準(zhǔn)確水浴30min
顯色劑 | 200 | 200 | 200 | 200 |
37℃水浴20min后,700nm下測(cè)定各管吸光值
注意:空白管和標(biāo)準(zhǔn)管通常只需要各做一個(gè)。每個(gè)測(cè)定管設(shè)一個(gè)對(duì)照管。
ATP含量計(jì)算:
1、血清(漿)中ATP含量計(jì)算
ATP含量(μmol/mL)=[C標(biāo)準(zhǔn)管×(A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管) ×V1]÷(V3×V1÷V2)=40×(A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)
2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中ATP含量計(jì)算
(1)按蛋白濃度計(jì)算
ATP含量(μmol/mg prot)=[C標(biāo)準(zhǔn)管×(A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管) ×V1]÷(V1÷Cpr)=2×(A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)÷Cpr
蛋白質(zhì)含量需要另外測(cè)定。
(2)按樣本鮮重計(jì)算
ATP含量(μmol/g鮮重)=[C標(biāo)準(zhǔn)管×(A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管) ×V1]÷(W×V1÷V2)=4×(A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)÷W
(3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算
ATP含量(μmol/104 cell)=[C標(biāo)準(zhǔn)管×(A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管) ×V1]÷(500×V1÷V2)=0.008×(A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)
C標(biāo)準(zhǔn)管:標(biāo)準(zhǔn)液濃度,2μmol/mL;V1:加入反應(yīng)體系中樣本體積,0.01mL;V2:加入提取液體積,2mL;V3:加入血清(漿)體積:0.1mL;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL; W:樣本質(zhì)量,g;500:細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù),500萬(wàn)。
注意:Z低檢測(cè)限為10nmol/mL或10nmol/g鮮重或0.1nmol/mg prot
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