H2S含量測定試劑盒說明書
微量法100T/96S
注 意:正式測定之前選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。
測定意義:
H2S是一種新型氣態(tài)信號分子,存在于腦內(nèi)的神經(jīng)遞質(zhì),生理濃度的H2S對神經(jīng)系統(tǒng)海馬的長時程增強功能具有重要的調(diào)節(jié)作用,并對自發(fā)性高血壓、出血性休克及肝硬化等疾病的過程發(fā)揮著重要的病理生理效應(yīng)。
測定原理:
H2S與醋酸鋅、N, N-二甲基對苯二胺和硫酸鐵銨等反應(yīng)生成亞甲基藍,亞甲基藍在665nm處有最大吸收峰,通過測定其吸光值可計算H2S含量。
自備實驗用品及儀器:
天平、低溫離心機、酶標(biāo)儀、96孔板、蒸餾水。
試劑組成和配制:
提取液:液體100mL×1瓶,4℃保存。
試劑一:液體25mL×1瓶,4℃保存。
試劑二:液體16mL×1瓶,4℃保存。
試劑三:液體8mL×1瓶,4℃避光保存。
試劑四:液體8mL×1瓶,4℃保存。
試劑五:液體1.5mL×1管,4℃避光保存。
樣品處理:
1. 組織:按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液)進行冰浴勻漿,然后10000g,4℃離心10min,取上清,置冰上待測。
2. 細菌、真菌:按照細胞數(shù)量(104個):提取液體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬細胞加入1mL提取液),冰浴超聲波破碎細胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時間3min);然后10000g,4℃,離心10min,取上清置于冰上待測。
3. 血清(漿):直接測定。
操作表:
1、 酶標(biāo)儀預(yù)熱30min,調(diào)節(jié)波長至665nm。
2、 操作表
空白管 | 測定管 | |
樣品(μL) | 150 | |
H2O(μL) | 150 | |
試劑一(μL) | 150 | 150 |
充分震蕩混勻 | ||
試劑二(μL) | 150 | 150 |
10000g,4℃,離心10min,去上清,留沉淀 | ||
H2O(μL) | 150 | 150 |
10000g,4℃,離心10min,去上清,留沉淀 | ||
試劑一(μL) | 75 | 75 |
試劑三(μL) | 75 | 75 |
充分震蕩混勻 | ||
試劑四(μL) | 75 | 75 |
10000rpm,4℃,離心10min,吸取200μL上清于96孔板中 | ||
試劑五(μL) | 10 | 10 |
混勻,25℃靜置5min,測定665nm吸光值,記為A測定和A空白,ΔA=A測定-A空白。 |
H2S含量計算公式:
用96孔板測定的計算公式如下
標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為:y = 0.0022x,R2 = 0.9988
(1)組織樣品
a.按照蛋白濃度計算
H2S(nmol/mg prot)=×V反總÷(V樣×Cpr)=681.8×ΔA÷Cpr
b.按照樣本重量計算
H2S(nmol/g 鮮重)=×V反總÷(V樣÷V樣總×W)= 681.8×ΔA÷W
(3) 細胞
H2S(nmol/104 cell)=×V反總÷(V樣÷V樣總×細胞數(shù)量(萬個))=681.8×ΔA÷細胞數(shù)量(萬個)
(2)液體樣品H2S(nmol/mL)=×V反總÷V樣= 681.8×ΔA
V反總:反應(yīng)總體積,0.225mL;V樣:反應(yīng)中樣品體積,0.15mL;V樣總:加入提取液體積,1mL;W:樣品質(zhì)量,g;Cpr:蛋白濃度,mg/mL
注意事項:
Z低檢出限為1nmol/mL。
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