維生素E(Vitamin E,VE)試劑盒說明書
微量法100T/48S
測定意義:
維生素E(Vitamin E)是一種脂溶性維生素,其水解產物為生育酚,是生物體中最主要的抗氧化劑之一,能阻止不飽和脂肪酸收到過氧化作用的損傷,維持不飽和脂肪酸細胞膜的完整性和正常功能,具有延緩衰老、預防溶血性貧血作用,在醫(yī)藥、化妝品、保健品、食品行業(yè)具有較高的應用價值。
測定原理:
VE還原Fe3+為Fe2+,Fe2+與1,10-菲羅啉產生有色絡合物,在530nm有特征吸收峰。
自備實驗用品及儀器:
天平、研缽、離心機、可見分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96孔板、漩渦震蕩儀。
試劑組成和配制:
提取液:液體100mL×1瓶,4℃保存。
試劑一:液體2mL×1瓶,4℃避光保存。
試劑二:液體2mL×1支,4℃保存。
試劑三:液體2mL×1支,4℃保存。
試劑四:液體6mL×1瓶,4℃保存。
樣本處理:
1. 組織:按照質量(g):提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g,加入1mL提取液)加入提取液,勻漿后用提取液定至1mL,定至在漩渦混勻儀上震蕩5min,于25℃,5000g離心10min,取上層測定。
2. 細胞:按照細胞數量(104個):提取液體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬細胞加入1mL提取液),冰浴超聲波破碎細胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時間3min)后在漩渦混勻儀上震蕩5min,于25℃,5000g離心10min,取上層測定。
3. 血清:取0.1mL,加0.9mL提取液,漩渦儀混勻上震蕩5min,于25℃,5000g離心10min,取上層測定。
測定操作:
對照管 | 測定管 | |
樣品(μL) | 100 | 100 |
試劑一(μL) | 20 | 20 |
試劑二(μL) | 20 | |
試劑三(μL) | 20 | |
充分混勻,25℃反應5min | ||
試劑四(μL) | 60 | 60 |
充分混勻,于微量石英比色皿/96孔板,無水乙醇調零,測定530nm處吸光值,記為A對照管和A測定管,△A=A測定管-A對照管。 |
計算公式:
a. 用微量石英比色皿測定的計算公式如下
標準曲線:y = 0.22x + 0.0065 R2 = 0.9978
1. 按照蛋白含量計算
VE含量(μg/mg prot)=(△A -0.0065)÷ 0.22×V反總÷(V樣×Cpr)
= 9.09×(△A -0.0065)÷ Cpr
2. 按照樣本質量計算
VE含量(μg/g)= (△A -0.0065)÷ 0.22×V反總÷(V樣×W÷V樣總)
= 9.09×(△A -0.0065)÷ W
3. 按照細胞數量計算
VE含量(μg/104 cell)=(△A -0.0065)÷ 0.22×V反總÷(V樣×細胞數量÷V樣總)
= 9.09×(△A -0.0065)÷ 細胞數量
4. 按照液體體積計算
VE含量(μg/mL)=(△A -0.0065)÷ 0.22×V反總÷V樣×10
= 90.9×(△A -0.0065)
V反總:反應總體積,0.2mL;V樣:加入樣本體積,0.1mL;V樣總:加入提取液體積,1mL;Cpr:蛋白濃度,mg/mL;W:樣本質量,g
b. 用96孔板測定的計算公式如下
標準曲線:y = 0.11x + 0.0065 R2 = 0.9978
1. 按照蛋白含量計算
VE含量(μg/mg prot)=(△A -0.0065)÷ 0.11×V反總÷(V樣×Cpr)
= 18.18×(△A -0.0065)÷ Cpr
2. 按照樣本質量計算
VE含量(μg/g)= (△A -0.0065)÷0.11×V反總÷(V樣×W÷V樣總)
= 18.18×(△A -0.0065)÷ W
3. 按照細胞數量計算
VE含量(μg/104 cell)=(△A -0.0065)÷ 0.11×V反總÷(V樣×細胞數量÷V樣總)
= 18.18×(△A -0.0065)÷ 細胞數量
4. 按照液體體積計算
VE含量(μg/mL)=(△A -0.0065)÷0.11×V反總÷V樣×10
= 181.8×(△A -0.0065)
V反總:反應總體積,0.2mL;V樣:加入樣本體積,0.1mL;V樣總:加入提取液體積,1mL;Cpr:蛋白濃度,mg/mL;W:樣本質量,g
注意事項:
若反應體系產生沉淀,需要將樣品進行適當的稀釋,并在計算公式中乘以稀釋倍數。
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