維生素B6(Vitamin B6,VB6)試劑盒說明書
微量法100T/96S
注 意 :正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。
測(cè)定意義:
維生素B6(Vitamin B6)又稱吡哆素,其包括吡哆醇、吡哆醛及吡哆胺,在體內(nèi)以磷酸酯的形式存在,是一種水溶性維生:素,在細(xì)胞中參與多種蛋白質(zhì)和氨基酸的代謝,對(duì)生物體具有極其重要的作用。
測(cè)定原理:
VB6與4-氨基安替比林在強(qiáng)氧化劑作用下生成穩(wěn)定的黃色化合物,在390nm有特征吸收峰。
自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器:
天平、研缽、離心機(jī)、可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板、恒溫水浴鍋、蒸餾水。
試劑組成和配制 :
提取液:液體70mL×1瓶,4℃保存。
試劑一:液體1mL×1瓶,4℃保存。
試劑二:液體5mL×1瓶,4℃保存。
試劑三:液體8mL×1瓶,4℃避光保存。
試劑四:液體8mL×1瓶,4℃避光保存。
樣本處理:
1. 組織:將樣品磨碎,按照質(zhì)量(g):提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g,加入0.6mL提取液)加入提取液,60℃浸提30min,加蒸餾水0.4mL,混勻后于25℃,16000rpm離心10min,取上清測(cè)定(動(dòng)物組織等蛋白含量較高的樣本建議離心20-30分鐘)。
2. 細(xì)胞:按照細(xì)胞數(shù)量(104個(gè)):提取液體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬細(xì)胞加入0.6mL提取液),冰浴超聲波破碎細(xì)胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時(shí)間3min);加蒸餾水0.4mL,混勻后于25℃,16000rpm離心10min,取上清測(cè)定。
3. 血清:直接測(cè)定。
測(cè)定操作:
空白管 | 測(cè)定管 | |
樣品(μL) | 40 | |
試劑一(μL) | 40 | |
試劑二(μL) | 40 | 40 |
試劑三(μL) | 60 | 60 |
試劑四(μL) | 60 | 60 |
充分混勻,25℃反應(yīng)20min,于微量石英比色皿/96孔板,測(cè)定390nm處吸光值,記為A空白管和A測(cè)定管,△A=A測(cè)定管-A空白管??瞻坠苤灰鲆还?。 |
計(jì)算公式:
a. 用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下
標(biāo)準(zhǔn)曲線:y = 0.3635x+0.0205,R2 = 0.9986
1. 按照蛋白含量計(jì)算
VB6含量(μg/mg prot)=(△A - 0.0205)÷ 0.3635×V反總÷(V樣×Cpr)
= 13.76×(△A - 0.0205)÷ Cpr
2. 按照樣本質(zhì)量計(jì)算
VB6含量(μg/g)=(△A - 0.0205)÷ 0.3635×V反總÷(V樣×W÷V樣總)
= 13.76×(△A - 0.0205)÷ W
3. 按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算
VB6含量(μg/104 cell)=(△A - 0.0205)÷ 0.3635×V反總÷(V樣×細(xì)胞數(shù)量÷V樣總)
= 13.76×(△A - 0.0205)÷ 細(xì)胞數(shù)量
4. 按照液體體積計(jì)算
VB6含量(μg/mL)=(△A - 0.0205)÷ 0.3635×V反總÷V樣
= 13.76×(△A - 0.0205)
V反總:反應(yīng)總體積,0.2mL;:V樣:加入樣本體積,0.04mL;V樣總:加入提取液體積,1mL; Cpr:蛋白濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g
b.用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下
標(biāo)準(zhǔn)曲線:y = 0.1818x+0.0205,R2 = 0.9986
1. 按照蛋白含量計(jì)算
VB6含量(μg/mg prot)=(△A - 0.0205)÷ 0.1818×V反總÷(V樣×Cpr)
= 27.52×(△A - 0.0205)÷ Cpr
2. 按照樣本質(zhì)量計(jì)算
VB6含量(μg/g)=(△A - 0.0205)÷ 0.1818 ×V反總÷(V樣×W÷V樣總)
= 27.52×(△A - 0.0205)÷ W
3. 按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算
VB6含量(μg/104 cell)=(△A - 0.0205)÷ 0.1818×V反總÷(V樣×細(xì)胞數(shù)量÷V樣總)
= 27.52×(△A - 0.0205)÷ 細(xì)胞數(shù)量
4. 按照液體體積計(jì)算
VB6含量(μg/mL)=(△A - 0.0205)÷ 0.1818×V反總÷V樣
=27.52×(△A - 0.0205)
V反總:反應(yīng)總體積,0.2mL;:V樣:加入樣本體積,0.04mL;V樣總:加入提取液體積,1mL; Cpr:蛋白濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g
注意事項(xiàng)
1. 若測(cè)定結(jié)果中吸光值超過1,請(qǐng)將樣本稀釋后進(jìn)行測(cè)定,并在計(jì)算公式中乘以稀釋倍數(shù)。
2. 蛋白濃度較高的樣品,比如動(dòng)物組織,若顯色完成后有沉淀產(chǎn)生,將樣本稀釋后再測(cè)定,在計(jì)算公式中乘以稀釋倍數(shù)。
3. 顯色完成后立即進(jìn)行測(cè)定。
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