維生素B6（Vitamin B6，VB6）試劑盒說明書

       微量法100T/96S

注   意 ：正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

測(cè)定意義：

維生素B6（Vitamin B6）又稱吡哆素，其包括吡哆醇、吡哆醛及吡哆胺，在體內(nèi)以磷酸酯的形式存在，是一種水溶性維生：素，在細(xì)胞中參與多種蛋白質(zhì)和氨基酸的代謝，對(duì)生物體具有極其重要的作用。

測(cè)定原理：

VB6與4-氨基安替比林在強(qiáng)氧化劑作用下生成穩(wěn)定的黃色化合物，在390nm有特征吸收峰。

自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器：

天平、研缽、離心機(jī)、可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板、恒溫水浴鍋、蒸餾水。

試劑組成和配制 ：

提取液：液體70mL×1瓶，4℃保存。

試劑一：液體1mL×1瓶，4℃保存。

試劑二：液體5mL×1瓶，4℃保存。

試劑三：液體8mL×1瓶，4℃避光保存。

試劑四：液體8mL×1瓶，4℃避光保存。

樣本處理：

1.        組織：將樣品磨碎，按照質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g，加入0.6mL提取液）加入提取液，60℃浸提30min，加蒸餾水0.4mL，混勻后于25℃，16000rpm離心10min，取上清測(cè)定（動(dòng)物組織等蛋白含量較高的樣本建議離心20-30分鐘）。

2.        細(xì)胞：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)胞加入0.6mL提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）；加蒸餾水0.4mL，混勻后于25℃，16000rpm離心10min，取上清測(cè)定。

3.        血清：直接測(cè)定。               

測(cè)定操作：

計(jì)算公式：
a. 用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)曲線：y = 0.3635x+0.0205，R² = 0.9986

1. 按照蛋白含量計(jì)算

VB6含量（μg/mg prot）=（△A - 0.0205）÷ 0.3635×V反總÷（V樣×Cpr）

                    = 13.76×（△A - 0.0205）÷ Cpr

2. 按照樣本質(zhì)量計(jì)算

VB6含量（μg/g）=（△A - 0.0205）÷ 0.3635×V反總÷（V樣×W÷V樣總）

                = 13.76×（△A - 0.0205）÷ W

3. 按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

VB6含量（μg/10⁴ cell）=（△A - 0.0205）÷ 0.3635×V反總÷（V樣×細(xì)胞數(shù)量÷V樣總）

                     = 13.76×（△A - 0.0205）÷ 細(xì)胞數(shù)量

4. 按照液體體積計(jì)算

VB6含量（μg/mL）=（△A - 0.0205）÷ 0.3635×V反總÷V樣

                  = 13.76×（△A - 0.0205）

V反總：反應(yīng)總體積，0.2mL；：V樣：加入樣本體積，0.04mL；V樣總：加入提取液體積，1mL； Cpr：蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g

b．用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)曲線：y = 0.1818x+0.0205，R² = 0.9986

1. 按照蛋白含量計(jì)算

VB6含量（μg/mg prot）=（△A - 0.0205）÷ 0.1818×V反總÷（V樣×Cpr）

                    = 27.52×（△A - 0.0205）÷ Cpr

2. 按照樣本質(zhì)量計(jì)算

VB6含量（μg/g）=（△A - 0.0205）÷ 0.1818 ×V反總÷（V樣×W÷V樣總）

                = 27.52×（△A - 0.0205）÷ W

3. 按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

VB6含量（μg/10⁴ cell）=（△A - 0.0205）÷ 0.1818×V反總÷（V樣×細(xì)胞數(shù)量÷V樣總）

                     = 27.52×（△A - 0.0205）÷ 細(xì)胞數(shù)量

4. 按照液體體積計(jì)算

VB6含量（μg/mL）=（△A - 0.0205）÷ 0.1818×V反總÷V樣

                  =27.52×（△A - 0.0205）

V反總：反應(yīng)總體積，0.2mL；：V樣：加入樣本體積，0.04mL；V樣總：加入提取液體積，1mL； Cpr：蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g

注意事項(xiàng)

1.        若測(cè)定結(jié)果中吸光值超過1，請(qǐng)將樣本稀釋后進(jìn)行測(cè)定，并在計(jì)算公式中乘以稀釋倍數(shù)。

2.        蛋白濃度較高的樣品，比如動(dòng)物組織，若顯色完成后有沉淀產(chǎn)生，將樣本稀釋后再測(cè)定，在計(jì)算公式中乘以稀釋倍數(shù)。

3.        顯色完成后立即進(jìn)行測(cè)定。