維生素B1(Vitamin B1,VB1)試劑盒說明書
微量法100T/96S
注 意 :正式測定之前選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。
測定意義:
維生素B1(Vitamin B1)是構(gòu)成脫羧輔酶的主要成分,參與細胞代謝中的三羧酸循環(huán),是維持機體正常代謝必須的水溶性維生素,在生物體能量代謝中有重要的作用。
測定原理:
VB1在堿性條件下還原鐵氰hua鉀生成亞鐵氰hua鉀,亞鐵氰hua鉀與Fe3+在弱酸條件下生成普魯士藍,在704nm有特征吸收峰。
自備實驗用品及儀器:
天平、研缽、離心機、可見分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96孔板、恒溫水浴鍋、蒸餾水。
試劑組成和配制:
提取液:液體70mL×1瓶,4℃保存。
試劑一:液體1mL×1瓶,4℃保存。
試劑二:液體2mL×1支,4℃保存。
試劑三:液體2mL×1瓶,4℃避光保存。
試劑四:液體5mL×1瓶,4℃保存。
試劑五:液體3mL×1瓶,4℃避光保存。
樣本處理:
1. 組織:將樣品磨碎,按照質(zhì)量(g):提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g,加入0.6mL提取液)加入提取液,60℃浸提30min,加蒸餾水0.4mL,混勻后于25℃,16000rpm離心10min,取上清測定(動物組織等蛋白含量較高的樣本建議離心20-30min)。
2. 細胞:按照細胞數(shù)量(104個):提取液體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬細胞加入0.6mL提取液),冰浴超聲波破碎細胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時間3min);加蒸餾水0.4mL,混勻后于25℃,16000rpm離心10min,取上清測定。
3. 血清:直接測定。
測定操作:
空白管 | 測定管 | |
樣品(μL) | 20 | |
試劑一(μL) | 20 | |
試劑二(μL) | 16 | 16 |
試劑三(μL) | 20 | 20 |
充分混勻,80℃反應(yīng)10min | ||
提取液(μL) | 16 | 16 |
試劑四(μL) | 44 | 44 |
試劑五(μL) | 24 | 24 |
H2O(μL) | 60 | 60 |
充分混勻,靜置20min,于微量石英比色皿/96孔板,蒸餾水調(diào)零,測定704nm處吸光值,記為A空白管和A測定管,△A=A測定管-A空白管。 |
計算公式:
a. 用微量石英比色皿測定的計算公式如下
標準曲線:y = 0.017x+0.0031,R2 = 0.9991;x為標準品濃度:μg/mL;y為△A(A測定管-A空白管)
1. 按照蛋白含量計算
VB1含量(μg/mg prot)=(△A-0.0031)÷ 0.017÷Cpr
= 58.8×(△A-0.0031)÷ Cpr
2. 按照樣本質(zhì)量計算
VB1含量(μg/g鮮重)=(△A-0.0031)÷ 0.017÷(W÷V樣總)
= 58.8×(△A-0.0031)÷ W
3. 按照細胞數(shù)量計算
VB1含量(μg/104 cell)=(△A-0.0031)÷ 0.017÷(細胞數(shù)量÷V樣總)
= 58.8×(△A-0.0031)÷ 細胞數(shù)量
4. 按照液體體積計算
VB1含量(μg/mL)=(△A-0.0031)÷ 0.017
= 58.8×(△A-0.0031)
V樣總:加入提取液體積,1mL;Cpr:蛋白濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g
b.用96孔板測定的計算公式如下
標準曲線:y = 0.0085x +0.0031,R2 = 0.9991;x為標準品濃度:μg/mL;y為△A(A測定管-A空白管)
1. 按照蛋白含量計算
VB1含量(μg/mg prot)=(△A -0.0031)÷ 0.0085÷Cpr
= 117.65×(△A-0.0031)÷ Cpr
2. 按照樣本質(zhì)量計算
VB1含量(μg/g鮮重)=(△A-0.0031))÷ 0.0085÷(W÷V樣總)
= 117.65×(△A-0.0031)÷ W
3. 按照細胞數(shù)量計算
VB1含量(μg/104 cell)=(△A-0.0031)÷ 0.0085÷(細胞數(shù)量÷V樣總)
= 117.65×(△A-0.0031)÷ 細胞數(shù)量
4. 按照液體體積計算
VB1含量(μg/mL)=(△A-0.0031)÷ 0.0085
= 117.65×(△A-0.0031)
V樣總:加入提取液體積,1mL;Cpr:蛋白濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g
注意事項:
1. 若測定結(jié)果中吸光值超過2,請將樣本稀釋后進行測定,并在計算公式中乘以稀釋倍數(shù)。
2. 蛋白濃度較高的樣品,比如動物組織,若顯色完成后有沉淀產(chǎn)生,將樣本稀釋后再重新測定,并在計算公式中乘以稀釋倍數(shù)。
3. 顯色完成后立即進行測定。
4. 標準曲線線性范圍為0.1-10μg/mL。
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