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Ca++ Mg++- ATP酶活性測定試劑盒說明書

發(fā)布時間:2023/10/31      點(diǎn)擊次數(shù):296

Ca++ Mg++- ATP酶活性測定試劑盒說明書

                                        微量法 100/48

 

    意:正式測定前務(wù)必取2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義:

Ca++ Mg++-ATP酶廣泛分布于植物、動物、微生物和細(xì)胞中,可催化ATP水解生成ADP和無機(jī)磷。

 

測定原理:

根據(jù)Ca++ Mg++-ATP酶分解ATP生成ADP及無機(jī)磷,通過測定無機(jī)磷的量來確定ATP酶活性高低。

 

需自備的儀器及用品:

可見分光光度計/酶標(biāo)儀、水浴鍋、臺式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。

 

試劑的組成和配制:

提取液:液體100mL ×1 瓶,4保存。

試劑一:液體 10mL×1 瓶,4保存。

試劑二:粉劑×1瓶,-20保存;臨用前加入6mL蒸餾水充分混勻待用用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復(fù)凍融。

試劑三:液體 2mL×1 瓶,4保存。

試劑四:粉劑×1瓶,4保存。用時加入3mL蒸餾水, 4保存。

試劑五:粉劑×1, 4保存。用時加入25mL蒸餾水,溶解后4保存一周。

試劑六:粉劑×1, 4保存。用時加入25mL蒸餾水,溶解后4保存一周。

試劑七:液體25mL×1 瓶,室溫保存。

試劑八:10mmol/L 標(biāo)準(zhǔn)磷貯備液 10mL×1 瓶,4保存。

0.5μmol/mL 標(biāo)準(zhǔn)磷應(yīng)用液配制:將試劑八 20倍稀釋,即取 0.1mL試劑八加1.9mL蒸餾水充分混勻。

定磷劑的配制:H2O: 試劑五:試劑六:試劑七=2:1:1:1 的比例配制,配好的定磷劑應(yīng)為淺黃色。若無色則試劑失效,若是藍(lán)色則為磷污染,定磷劑現(xiàn)用現(xiàn)配。

注意:配試劑最好用新的燒杯、玻棒和玻璃移液器,也可以用一次性塑料器皿,避免磷污染。

 

樣品酶液的制備:

1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備:

細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞:先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量(104個):提取液體積(mL)為500~10001的比例(建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液),超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞(冰浴,功率20%或200W,超聲3s,間隔10s,重復(fù)30次);8000g 4離心10min,取上清,置冰上待測。

組織:按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)15~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液),進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4離心10min,取上清,置冰上待測。

2、血清(漿)樣品:直接檢測。

 

 

操作步驟:

1、分光光度計或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長至660nm,蒸餾水調(diào)零。

2、酶促反應(yīng)(在EP管中加入下列試劑)


對照管

測定管

試劑一μL

65

45

試劑二(μL

60

60

試劑三(μL


20

 樣本 μL


100

混勻,37℃(哺乳動物)或25℃(其他物種)準(zhǔn)確水浴10min

試劑四(μL

25

25

 樣本 μL

100


混勻,8000g,25離心10min,取上清液

3、定磷(EP管或96孔板中加入下列試劑


空白管

標(biāo)準(zhǔn)管

對照管

測定管

0.5μmol/ml標(biāo)準(zhǔn)磷應(yīng)用液(μL


20



上清液(μL



20

20

蒸餾水(μL

20




定磷試劑(μL

200

200

200

200

混勻,室溫放置30min,在 660nm處,記錄各管吸光值。

 

注意事項:

1、由于每一個樣都必須做對照,本試劑盒100管只能測 48Ca++ Mg++-ATP酶。

2、此法具有微量、靈敏、快速的特點(diǎn)。所以對測定所用試管要求嚴(yán)格無磷。避免磷污染是檢測成敗的關(guān)鍵。

3、空白管和標(biāo)準(zhǔn)管只要做一管。

Ca++ Mg++-  ATPase活力的計算:

1、血清(漿)Ca++ Mg++-  ATPase活力的計算:

定義:每小時每毫升血清(漿)中Ca++ Mg++- ATP 酶分解ATP 產(chǎn)生1μmol無機(jī)磷的量為一個酶活力單位。

Ca++ Mg++-ATP酶活力(μmol/h/mL= [C標(biāo)準(zhǔn)管×V]×A測定管-A對照管)÷A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)÷V÷T=7.5×A測定管-A對照管)÷A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中Ca++ Mg++-  ATPase活力的計算:

1)按蛋白濃度計算:

定義:每小時每毫克組織蛋白中Ca++ Mg++- ATP 酶分解ATP 產(chǎn)生1μmol無機(jī)磷的量為一個酶活力單位。

Ca++ Mg++-ATP酶活力(μmol/h / mg prot)= [C標(biāo)準(zhǔn)管×V]×A測定管-A對照管)÷A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)÷V×Cpr÷T =7.5×A測定管-A對照管)÷A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)÷Cpr

2)按樣本鮮重計算:

定義:每小時每克組織中Ca++ Mg++-ATP 酶分解ATP 產(chǎn)生1μmol無機(jī)磷的量為一個酶活力單位。

Ca++ Mg++-ATP酶活力(μmol/h /g 鮮重)=[C標(biāo)準(zhǔn)管×V]×A測定管-A對照管)÷A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)÷(W× V÷V樣總)÷T=7.5×A測定管-A對照管)÷A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)÷W

3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算:

定義:每小時每1萬個細(xì)菌或細(xì)胞中Ca++ Mg++-ATP 酶分解ATP 產(chǎn)生1μmol無機(jī)磷的量為一個酶活力單位。

Ca++ Mg++-ATP酶活力(μmol/h /104 cell)= [C標(biāo)準(zhǔn)管×V]×A測定管-A對照管)÷A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)÷(500×V÷V樣總)÷T=0.015×A測定管-A對照管)÷A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)

 

C標(biāo)準(zhǔn)管:標(biāo)準(zhǔn)管濃度,0.5μmol/mL;V總:酶促反應(yīng)總體積,0.25mL;V樣:加入樣本體積,0.1mL ;V樣總:加入提取液體積,1mL;T:反應(yīng)時間,1/6小時;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mLW:樣本鮮重,g;500:細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),500萬。


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