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糖原磷酸化酶b(Glycogen phosphorylase b,GPb)試劑盒說明書

發(fā)布時(shí)間:2023/10/27      點(diǎn)擊次數(shù):265

糖原磷酸化酶bGlycogen phosphorylase b,GPb)試劑盒說明書

                                            微量法100/48

 

   意 :正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義:

糖原磷酸化酶(Glycogen phosphorylaseGP,EC 2.4.1.1))是糖原分解代謝的關(guān)鍵酶,使糖原分子從非還原端逐個(gè)斷開α-1,4-糖苷鍵移去葡萄糖基,釋放1-磷酸葡萄糖,直至臨近糖原分子α-1,6-糖苷鍵分支點(diǎn)前4個(gè)葡萄糖基處。GP分為有活性的糖原磷酸化酶aGPa)和無活性的糖原磷酸化酶bGPb)兩種形式。GPb在一定濃度的腺苷酸(5,-AMP)存在下可被激活。

 

測(cè)定原理:

GP催化糖原和無機(jī)磷產(chǎn)生葡萄糖殘基生成糖原和1-磷酸葡萄糖,磷酸葡萄糖變位酶和6-磷酸葡萄糖脫氫酶進(jìn)一步依次催化NADP還原生成NADPH,在340nm下測(cè)定NADPH上升速率,即可反映GP活性。添加一定濃度的腺苷酸(5-AMP)時(shí)測(cè)定GPGPaGPb)活性,未添加腺苷酸(5,-AMP)時(shí)測(cè)定GPa活性,GP性-GPa活性得到GPb活性。

 

需自備的儀器和用品:

紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。

 

試劑的組成和配制:

提取液:100mL×1瓶,4保存;

試劑一:液體16 mL×1瓶, 4保存;

試劑二:粉劑×1瓶,-20保存;

試劑三:粉劑×1支,-20保存;

試劑四:粉劑×1支, -20保存;

試劑五:粉劑×1支, -20保存;

 

樣本的前處理:

按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)15~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液),進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4離心10min,取上清,置冰上待測(cè)。

 

測(cè)定步驟:

1、  分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至340nm,蒸餾水調(diào)零;

2、  工作液的配制:臨用前將試劑二轉(zhuǎn)移到試劑一中混合溶解待用;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復(fù)凍融。

3、  試劑三的配制:臨用前在試劑三瓶中加入1mL蒸餾水充分溶解待用;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復(fù)凍融。

4、  試劑四的配制:臨用前在試劑四瓶中加入1mL蒸餾水充分溶解待用;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復(fù)凍融。

5、   試劑五的配制:臨用前在試劑五管中加入500μL蒸餾水充分溶解待用;用不完的試劑分裝后-20℃保

 

6、   存,禁止反復(fù)凍融。

7、   將工作液、試劑三、試劑四和試劑五置于37預(yù)熱5分鐘;

8、   在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本、10μL試劑三、10μL試劑四、10μL蒸餾水160μL工作液,立即混勻,記錄340nm5min后的A110min后的吸光值A2,計(jì)算ΔAGPa=A2-A1。

9、   在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本、10μL試劑三、10μL試劑四、10μL試劑五160μL工作液,立即混勻,記錄340nm5min后的A310min后的吸光值A4,計(jì)算ΔAGP=A4-A3

注意:由于每個(gè)樣本需要同時(shí)測(cè)一個(gè)GPGPaGPb)活性和一個(gè)GPa活性,因此本試劑盒100管測(cè)48個(gè)樣本。

 

GPb活性計(jì)算:

a.用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下:

1)按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位定義:每mg組織蛋白每分鐘產(chǎn)生1nmol NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。

GPbnmol/min/mg prot)=[(ΔAGPΔAGPa)×V反總÷ε×d×109]÷(V×Cpr) ÷T=643×(ΔAGPΔAGPa)÷Cpr

2)按樣本鮮重計(jì)算

單位定義:每g組織每分鐘產(chǎn)生1nmol NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。

GPbnmol/min/g 鮮重)=[(ΔAGPΔAGPa)×V反總÷ε×d×109]÷(W ×V÷V樣總)÷T=643×(ΔAGPΔAGPa)÷W

V反總:反應(yīng)體系總體積,2×10-4 L;εNADPH摩爾消光系數(shù),6.22×103 L / mol /cmd:比色皿光徑,1cmV樣:加入樣本體積,0.01 mLV樣總:加入提取液體積,1 mL;T:反應(yīng)時(shí)間,5 minCpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mLW:樣本質(zhì)量,g。

 

b.96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下:

1)按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位定義:每mg組織蛋白每分鐘產(chǎn)生1nmol NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。

GPbnmol/min/mg prot)=[(ΔAGPΔAGPa)×V反總÷ε×d×109]÷(V×Cpr) ÷T=1286×(ΔAGPΔAGPa)÷Cpr

2)按樣本鮮重計(jì)算

單位定義:每g組織每分鐘產(chǎn)生1nmol NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。

GPbnmol/min/g 鮮重)=[(ΔAGPΔAGPa)×V反總÷ε×d×109]÷(W ×V÷V樣總)÷T=1286×(ΔAGPΔAGPa)÷W

V反總:反應(yīng)體系總體積,2×10-4 L;εNADPH摩爾消光系數(shù),6.22×103 L / mol /cm;d96孔板光徑,0.5cm;V樣:加入樣本體積,0.01 mLV樣總:加入提取液體積,1 mL;T:反應(yīng)時(shí)間,5 min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mLW:樣本質(zhì)量,g。


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