抗壞血酸氧化酶(ascorbate oxidase,AAO)活性測定試劑盒說明書
微量法100T/96S
注 意:正式測定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。
測定意義:
AAO是定位于植物細(xì)胞壁的糖蛋白,屬“藍(lán)銅氧化酶"家族。細(xì)胞壁內(nèi)的抗壞血酸和AAO與細(xì)胞壁的代謝和生長有著密切的聯(lián)系。AAO 氧化 AsA 所形成的 MDHA 可通過質(zhì)膜上的細(xì)胞色素b還原,該過程中電子的跨膜運(yùn)輸能夠促進(jìn)細(xì)胞生長。
測定原理:
AAO可直接氧化AsA,通過測定AsA的氧化量,可計(jì)算得AAO活力。
實(shí)驗(yàn)中所需儀器及設(shè)備:
低溫離心機(jī)、紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板(UV板)、可調(diào)式移液器、研缽、冰、蒸餾水。
試劑組成和配制:
試劑一:液體100mL×1瓶,4℃保存。
試劑二:液體20mL×1瓶,4℃保存。
試劑三:粉劑×1瓶,4℃保存。臨用前加入2mL蒸餾水充分溶解。
粗酶液提?。?/span>
按照組織質(zhì)量(g):試劑一體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL試劑一)進(jìn)行冰浴勻漿。16000g,4℃離心10min,取上清置冰上待測。
AAO測定操作:
1. 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30 min,調(diào)節(jié)波長到265 nm。
2. 試劑二在25℃水浴鍋中預(yù)熱30 min。
3. 依次在微量石英比色皿/96孔板中加入20μL上清液、170μL預(yù)熱的試劑二和10μL試劑三,迅速混勻后在265nm測定10s和130s光吸收A1和A2,△A =A1-A2。
AAO活性計(jì)算公式:
a.使用微量石英比色皿測定的計(jì)算公式如下
(1). 按蛋白濃度計(jì)算
AAO活性單位定義:25℃中每毫克蛋白每分鐘氧化1nmol AsA 為1個(gè)酶活單位。
AAO(nmol/min /mg prot) = △A÷(ε×d)×V反總×109÷(Cpr×V樣)÷T
= 92.4×△A÷Cpr
(2). 按樣本質(zhì)量計(jì)算
AAO活性單位定義:25℃中每克樣本每分鐘氧化1nmol AsA 為1個(gè)酶活單位。
AAO(nmol/min/g 鮮重) = △A÷(ε×d)×V反總×109÷(W×V樣÷V樣總)÷T
= 92.4×△A÷W
ε:AsA在265nm處摩爾吸光系數(shù)為5.42×104 L/mol/cm;d:比色皿光徑(cm),1 cm; V反總:反應(yīng)體系總體積(L),200μL=2×10-4 L;106:1mol=1×106μmol;Cpr:上清液蛋白質(zhì)濃度(mg/mL),需要另外測定,建議使用本公司BCA蛋白質(zhì)含量測定試劑盒;W :樣品質(zhì)量;V樣:加入反應(yīng)體系中上清液體積(mL),20μL=0.02 mL;V樣總:提取液體積,1 mL;
T:催化反應(yīng)時(shí)間(min),2min。
b.使用96孔板測定的計(jì)算公式如下
(1). 按蛋白濃度計(jì)算
AAO活性單位定義:25℃中每毫克蛋白每分鐘氧化1nmol AsA 為1個(gè)酶活單位。
AAO(nmol/min /mg prot) = △A÷(ε×d)×V反總×109÷(Cpr×V樣)÷T
=184.8×△A÷Cpr
(2). 按樣本質(zhì)量計(jì)算
AAO活性單位定義:25℃中每克樣本每分鐘氧化1nmol AsA 為1個(gè)酶活單位。
AAO(nmol/min/g 鮮重) = △A÷(ε×d)×V反總×109÷(W×V樣÷V樣總)÷T
= 184.8×△A÷W
ε:AsA在265nm處摩爾吸光系數(shù)為5.42×104 L/mol/cm;d:96孔板光徑(cm),0.5 cm; V反總:反應(yīng)體系總體積(L),200μL=2×10-4 L;106:1mol=1×106μmol;Cpr:上清液蛋白質(zhì)濃度(mg/mL),需要另外測定,建議使用本公司BCA蛋白質(zhì)含量測定試劑盒;W :樣品質(zhì)量;V樣:加入反應(yīng)體系中上清液體積(mL),20μL=0.02 mL;V樣總:提取液體積,1 mL;
T:催化反應(yīng)時(shí)間(min),2min。
注意事項(xiàng):
配制好的試劑放在4℃保存,三天內(nèi)使用完。
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