乳酸含量(lactic acid,LA)試劑盒說明書
微量法 100T/48S
注 意 :正式測(cè)定之前選擇 2-3 個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。
測(cè)定意義:
乳酸是生物體代謝過程中重要的中間產(chǎn)物,與糖代謝、脂類代謝、蛋白質(zhì)代謝及細(xì)胞內(nèi)能量代謝密切相關(guān),乳酸含量是評(píng)估糖元代謝的和有氧代謝的重要指標(biāo)。
測(cè)定原理:
乳酸在乳酸脫氫酶的作用下生成丙酮酸,同時(shí)使NAD+還原生成NADH 和H+,H+傳遞給PMS
生成的 PMSH2 還原 INT 生成紅色物質(zhì),在 530nm 處有特征吸收峰。
自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器:
天平、研缽、離心機(jī)、可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96 孔板、恒溫水浴鍋。
試劑組成和配制:
提取液:液體 110mL×1 瓶,4℃保存。
試劑一:液體 2mL×1 瓶,4℃保存。
試劑二:液體 5mL×1 瓶,4℃保存。
試劑三:粉劑×1 支,-20℃避光保存。臨用前加入 0.6mL 蒸餾水充分溶解。
試劑四:粉劑×1 瓶,4℃避光保存。臨用前加 6mL 蒸餾水充分溶解。
試劑五:粉劑×1 支,4℃避光保存。標(biāo)準(zhǔn)品:液體 1mL×1 支,4℃保存。
顯色液:臨用前根據(jù)用量按照提取液(V):試劑三(V):試劑四(V):試劑五(m)=1(mL): 0.3(mL):3(mL):15(mg)的比例充分混勻。(注意:現(xiàn)配現(xiàn)用,用多少配多少,在棕色瓶中配制,試劑盒中帶有 4 個(gè)棕色空瓶)
樣本處理:
1. 組織:按照質(zhì)量(g):提取液體積(mL)為 1:5~10 的比例(建議稱取約 0.1g,加入 1mL
提取液)加入提取液,冰浴勻漿后于 4℃,12000g 離心 10min,取上清測(cè)定。
2. 細(xì)胞:按照細(xì)胞數(shù)量(104 個(gè)):提取液體積(mL)為 500~1000:1 的比例(建議 500萬細(xì)胞加入 1mL 提取液),冰浴超聲波破碎細(xì)胞(功率 300w,超聲 3 秒,間隔 7 秒,總時(shí)間 3min);于 4℃,12000g 離心 10min,取上清測(cè)定。
3. 血清:直接測(cè)定。
測(cè)定操作:
樣品對(duì)照管 | 樣品測(cè)定管 | 標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照管 | 標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定管 | |
樣品(μL) | 10 | 10 | ||
標(biāo)準(zhǔn)品(μL) | 10 | 10 | ||
H2O(μL) | 60 | 90 | 60 | 90 |
試劑一(μL) | 30 | 30 | ||
試劑二(μL) | 40 | 40 | 40 | 40 |
顯色液(μL) | 60 | 60 | 60 | 60 |
注 意:標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照料管和標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定管只需測(cè)定一次,每個(gè)樣品測(cè)定管設(shè)一個(gè)樣品對(duì)照管。
計(jì)算公式:
1.按照蛋白含量計(jì)算
LA 含量(μmol/mg prot)= △A 樣÷△A 標(biāo)×C 標(biāo)÷ Cpr
= 2×△A 樣÷△A 標(biāo)÷ Cpr
2.按照樣本質(zhì)量計(jì)算
LA 含量(μmol/g 鮮重)= △A 樣÷△A 標(biāo)×C 標(biāo)÷ W
= 2×△A 樣÷△A 標(biāo)÷ W
3.按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算
LA 含量(μmol/104 cell)= △A 樣÷△A 標(biāo)×C 標(biāo)÷ 細(xì)胞數(shù)量
= 2×△A 樣÷△A 標(biāo)÷ 細(xì)胞數(shù)量
4.按照液體體積計(jì)算
LA 含量(μmol/mL)= △A 樣÷△A 標(biāo)×C 標(biāo)
= 2×△A 樣÷△A 標(biāo)
C 標(biāo):標(biāo)準(zhǔn)品濃度,2mmol/L;W:樣本質(zhì)量,g/mL;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL
注意事項(xiàng):
1.若吸光值超過 2,請(qǐng)進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂尯笤龠M(jìn)行測(cè)定,并在計(jì)算公式中乘以稀釋倍數(shù)。
2.Z低檢出限為 1.8μmol/L。
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