葡萄糖-6-磷酸( Glucose 6-phosphate, 6P G)含量測定試劑盒說明書
微量法 100管/48樣
注 意:正式測定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定
測定意義:
6PG (Glucose-6-phosphate,葡萄糖-6-磷酸,又稱6-磷酸葡萄糖),是糖酵解和磷酸戊糖途徑的中間產(chǎn)物,廣泛存在于動(dòng)植物體和微生物中。在糖酵解的第一步反應(yīng)中,葡萄糖被己糖激酶催化生成葡萄糖-6-磷酸,然后通過磷酸葡萄糖異構(gòu)酶的催化形成果糖-6-磷酸,以繼續(xù)糖酵解的其它步驟;而在戊糖磷酸途徑中,葡萄糖-6-磷酸是其第一個(gè)底物,該過程也是生成NADPH的主要途徑。此外,葡萄糖-6-磷酸也能轉(zhuǎn)化形成糖原或淀粉而被儲(chǔ)存起來。
測定原理:
6-磷酸葡萄糖脫氫酶可催化6PG和NADP+生成6磷酸葡萄糖酸和NADPH,NADPH在1-mPMS的作用下使WST-8顯橙黃色,在450 nm下測定吸光值。
需自備的儀器和用品:
酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、96孔板、研缽、冰、蒸餾水。
試劑的組成和配制:
提取液:液體60 mL×1瓶,4℃保存;
試劑一:液體12mL×1瓶, 4℃保存;
試劑二:粉劑×1瓶,-20℃保存;
試劑三:液體1.5mL×1管, 4℃避光保存。
6PG提?。?/p>
1、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞:先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量(104個(gè)):提取液體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液),超聲波破碎(冰浴,功率20%或200W,超聲3s,間隔10s,重復(fù)30次), 8000g,25℃離心10min,取上清待測。
2、組織:按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液),進(jìn)行冰浴勻漿,8000g,25℃離心10min,取上清待測。
3、血清(漿)等液體樣品:直接測定。
測定步驟:
1、酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長至450nm。
2、試劑二的配制:臨用前加入3mL水充分溶解待用,用不完的試劑分裝后-20℃保存;
3、工作液的配制:臨用前按照樣本數(shù)量,按以下比例配制工作液
試劑名稱(μL) | 測定工作液 | 對照工作液 |
試劑一 | 100 | 100 |
試劑二 | 50 | |
水 | 50 | |
試劑三 | 10 | 10 |
4、樣本測定
按下表在96孔板中加入如下試劑
試劑名稱(μL) | 測定管 | 對照管 |
樣本 | 50 | 50 |
測定工作液 | 150 | |
對照工作液 | 150 |
37℃避光孵育30min,450nm下測定吸光值A(chǔ)測定與A對照,△A=A測定-A對照。每個(gè)測定管需設(shè)一個(gè)對照管。
6PG含量計(jì)算:
1、標(biāo)準(zhǔn)條件下測定回歸方程為y = 3.8589x - 0.0016,R2 = 0.997; x為6PG含量(μmol/mL),y為吸光值。
2、按照血清(漿)體積計(jì)算
6PG含量(nmol/mL)= [(△A+0.0016)÷3.8589×V1]÷V1×1000
=259.1×(△A+0.0016)
3、按照蛋白濃度計(jì)算
6PG含量(nmol/mg prot)= [(△A+0.0016)÷3.8589×V1]÷(V1×Cpr)×1000
=259.1×(△A+0.0016) ÷Cpr
4、按照樣品質(zhì)量計(jì)算
6PG含量(nmol/g鮮重)= [(△A+0.0016)÷3.8589×V1]÷(W ×V1÷V2)×1000
=259.1×(△A+0.0016) ÷W
3、按照細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算
6PG含量(nmol/104 cell)= [(△A+0.0016)÷3.8589×V1]÷(500×V1÷V2)×1000
=0.518×(△A+0.0016)
V1:加入反應(yīng)體系中樣本體積,0.05mL;V2:加入提取液體積,1 mL; Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g;500:細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),500萬;1000,μmol到nmol的換算系數(shù)。
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