丙酮酸羧化酶（PC)試劑盒說(shuō)明書(shū)

                                     微量法100管/96樣

注    意：正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義：

丙酮酸羧化酶(pyruvate carboxylase，PC，EC 6.4.1.1)廣泛存在于動(dòng)物、霉菌和酵母的線粒體中，催化丙酮酸、ATP、CO₂和水生成草酰乙酸、ADP和Pi，是糖異生過(guò)程的第一個(gè)限速酶，在保證血糖的動(dòng)態(tài)平衡方面起著重要的作用。

測(cè)定原理：

PC催化丙酮酸、ATP、CO₂和水生成草酰乙酸、ADP和Pi，蘋(píng)果酸脫氫酶進(jìn)一步催化草酰乙酸和NADH生成蘋(píng)果酸和NAD⁺，在340nm下測(cè)定NADH氧化速率，即可反映PC活性。

需自備的儀器和用品：

分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制：

提取液：100mL×1瓶，4℃保存；

試劑一：液體18 mL×1瓶， 4℃保存；

試劑二：液體13uL×1支，4℃保存；

試劑三：粉劑×1支，-20℃保存；

試劑四：粉劑×1支，-20℃保存；

樣本的前處理：

組織、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：

1、   稱(chēng)取約0.1g組織或收集500萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞，加入1mL提取液，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。

2、   將勻漿600g，4℃離心5min。

3、   棄沉淀，將上清液移至另一離心管中，11000g，4℃離心10min。

4、   上清液即胞漿提取物，可用于測(cè)定從線粒體泄漏的PC（此步可選做）。

5、   在步驟④的沉淀中加入1mL提取液，超聲波破碎（冰浴，功率20％或200W，超聲3秒，間隔10秒，重復(fù)30次），用于線粒體PC活性測(cè)定。

測(cè)定步驟：

1、  分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至340nm，蒸餾水調(diào)零。

工作液的配制：臨用前將試劑二和試劑三轉(zhuǎn)移到試劑一中混合溶解待用；置于37℃(哺乳動(dòng)物)或25℃(其它物種)預(yù)熱5分鐘；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

試劑四的配制：在試劑四瓶中加入1mL蒸餾水充分溶解待用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

2、   在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本、10μL試劑四和180μL工作液，立即混勻，記錄340nm處初始吸光值A1和 2min后的吸光值A2，計(jì)算ΔA=A1-A2。

注意：在該試劑盒中，若ΔA大于0.5，需將樣本用提取液稀釋適當(dāng)倍數(shù)后測(cè)定，使ΔA小于0.5可提高檢測(cè)靈敏度。計(jì)算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)。

PC活性計(jì)算：

a.用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

PC（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T=1608×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計(jì)算

單位定義：每g組織每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

PC（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W ×V樣÷V樣總)÷T=1608×ΔA÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位定義：每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

PC（nmol/min/10⁴ cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=3.215×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積，2×10^-4 L；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.01 mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，2 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬(wàn)。

b.用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

PC（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T=3216×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計(jì)算

單位定義：每g組織每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

PC（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W ×V樣÷V樣總)÷T=3216×ΔA÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位定義：每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

PC（nmol/min/10⁴ cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=6.43×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積，2×10^-4 L；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm；d：96孔板光徑，0.5cm；V樣：加入樣本體積，0.01 mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，2 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬(wàn)。