土壤中性木聚糖酶(Soil Neutral Xylanase,S-NEX)測定
試劑盒說明書
微量法100T/48S
注 意 :正式測定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。
測定意義:
木聚糖酶(EC 3.2.1.8)主要由微生物產(chǎn)生,能催化水解木聚糖,也被稱為戊聚糖酶或半纖維素酶,可分解釀造或飼料工業(yè)中的原料細(xì)胞壁以及β-葡聚糖,降低釀造中物料的粘度,促進(jìn)有效物質(zhì)的釋放,以及降低飼料中的非淀粉多糖,促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用,因而廣泛的應(yīng)用于釀造和飼料工業(yè)中,NEX一般分離自最適生長pH為6-8的微生物。
測定原理:
NEX在中性環(huán)境中催化木聚糖降解成還原性寡糖和單糖,在沸水浴條件下進(jìn)一步與3,5-二硝基水楊酸發(fā)生顯色反應(yīng),在540nm處有特征吸收峰,反應(yīng)液顏色的深淺與酶解產(chǎn)生的還原糖量成正比,通過測定反應(yīng)液在540nm吸光值增加速率,可計(jì)算NEX活力。
自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器:
天平、常溫離心機(jī)、震蕩儀、恒溫水浴鍋、可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板。
試劑組成和配制:
緩沖液:液體10mL×1瓶,4℃保存。
試劑一:液體3mL×1瓶,4℃避光保存。
試劑二:液體10mL×1瓶,4℃避光保存。
樣品處理:
新鮮土樣風(fēng)干,過30-50目篩。
測定操作表:
1、 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min,調(diào)節(jié)波長至540nm。
2、 操作表
對照管 | 測定管 | |
土樣(g) | 0.02 | 0.02 |
緩沖液(μL) | 150 | 100 |
試劑一(μL) | 50 | |
混勻,50℃震蕩反應(yīng)30min,立即90℃水浴10min,8000g,25℃離心10min,取上清100μL | ||
試劑二(μL) | 100 | 100 |
混勻,90℃水浴中顯色5min,取180μL于微量石英比色皿/96孔板測定540nm處吸光值A,分別記為A對照管、A測定管,△A=A測定管-A對照管。 |
S-NEX計(jì)算公式:
a. 用微量石英比色皿測定的計(jì)算公式如下
標(biāo)準(zhǔn)曲線:y = 1.6904x + 0.0058,R2 = 0.9989
酶活定義:50℃,pH6.0條件下,每克土壤每天分解木聚糖產(chǎn)生1μmol 還原糖所需的酶量為一個(gè)酶活單位。
S-NEX活力(μmol/d/g土樣)=(△A-0.0058)÷ 1.6904×V反總×103÷ W÷T÷ 150
= 28.4×(△A -0.0058)÷ W
V反總:反應(yīng)總體積,0.15mL;T:反應(yīng)時(shí)間,1/48d;1000:1mmol/L =103μmol/L;150:木糖分子量。
b.用96孔板測定的計(jì)算公式如下
標(biāo)準(zhǔn)曲線:y = 0.8452x + 0.0058,R2 = 0.9989
酶活定義:50℃,pH6.0條件下,每克土壤每天分解木聚糖產(chǎn)生1μmol 還原糖所需的酶量為一個(gè)酶活單位。
S-NEX活力(μmol/d/g土樣)=(△A-0.0058)÷ 0.8452×V反總×103÷ W÷T÷ 150
= 56.8×(A540-0.0058)÷ W
V反總:反應(yīng)總體積,0.15mL;T:反應(yīng)時(shí)間,1/48d;1000:1mmol/L =103μmol/L;150:木糖分子量。
注意事項(xiàng):
1. 保證震蕩反應(yīng)30min,使酶與底物充分接觸。
2. 注意90℃水浴防止爆開,以免改變反應(yīng)體系。
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