土壤中性磷酸酶(S-NP)活性測(cè)定試劑盒說明書
微量法100T/96S
注 意 :正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。
測(cè)定意義:
土壤磷酸酶是催化土壤有機(jī)磷礦化的酶,其活性的高低直接影響著土壤中有機(jī)磷的分解轉(zhuǎn)化及其生物有效性,是評(píng)價(jià)土壤磷素生物轉(zhuǎn)化方向與強(qiáng)度的指標(biāo)。磷酸酶活性受到土壤碳、氮含量、有效磷含量和pH的顯著影響,根據(jù)最適PH范圍,一般把土壤磷酸酶分為中性、酸性和堿性三種類型。
測(cè)定原理:
中性環(huán)境中,S-NP催化磷酸苯二鈉水解生成苯酚和磷酸氫二鈉,通過測(cè)定酚的生成量即可計(jì)算出NP活性。
自備儀器和用品:
可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量玻璃比色皿/96孔板、臺(tái)式離心機(jī)、37℃恒溫培養(yǎng)箱、分析天平、可調(diào)式移液器、冰、蒸餾水、乙醇和甲苯。
試劑組成和配制:
試劑一:液體×1瓶,4℃避光保存。
試劑二:粉劑×1瓶,4℃保存。用前加100mL蒸餾水充分溶解。
試劑三:液體×1瓶,4℃保存。
試劑四:粉劑×1瓶,4℃避光保存。臨用前加576μL無水乙醇(自備),24μL蒸餾水充分溶解。(變褐色后不能再使用)
標(biāo)準(zhǔn)品:液體×1瓶,0.5 μmol/mL酚標(biāo)準(zhǔn)液,4℃保存。
催化反應(yīng):
稱取風(fēng)干混勻土壤約0.1g,加入50μL甲苯(自備),輕搖15min;加400μL試劑一并且搖勻后,置于37℃恒溫培養(yǎng)箱,開始計(jì)時(shí),催化反應(yīng)24h;到時(shí)后迅速加入1mL試劑二充分混勻,以終止酶催化的反應(yīng)。8000g,25℃離心10min,取上清液置于冰上待測(cè)。
顯色反應(yīng):
1. 分光光度計(jì)預(yù)熱30 min以上,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到660 nm,蒸餾水調(diào)零。
2. 空白管:取微量玻璃比色皿/酶標(biāo)板,加入10μL蒸餾水,20μL試劑三,4μL試劑四,充分混勻,顯色后再加蒸餾水166μL,混勻后25℃靜置30min,于660nm測(cè)定吸光度,記為A空白管。
3. 標(biāo)準(zhǔn)管:取微量玻璃比色皿/酶標(biāo)板,加入10μL標(biāo)準(zhǔn)液,20μL試劑三,4μL試劑四,充分混勻,顯色后再加蒸餾水166μL,混勻后25℃靜置30 min,于660nm測(cè)定吸光度,記為A標(biāo)準(zhǔn)管。
4. 測(cè)定管:取微量玻璃比色皿/酶標(biāo)板,加入10μL上清液,20μL試劑三,4μL試劑四,充分混勻,顯色后再加蒸餾水166μL,混勻后室溫25℃30 min,于660nm測(cè)定吸光度,記為A測(cè)定管。
注意:空白管和標(biāo)準(zhǔn)管只需測(cè)定一次。
S-NP活性計(jì)算:
a.使用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下
活性單位定義:37℃中每克土壤每天釋放1nmol酚為1個(gè)酶活單位。
S-NP(μmol/d/g 土樣)=[C標(biāo)準(zhǔn)液×(A測(cè)定管-A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)]×V總÷W÷T
= 0.725×(A測(cè)定管-A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)÷W
C標(biāo)準(zhǔn)液:0.5μmol/mL;V總:催化體系總體積,1.45mL;W:土壤樣品質(zhì)量,g;T:催化反應(yīng)時(shí)間,24 h=1 d。
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