線粒體檸檬酸(Mitochondrion citric acid, MCA)含量試劑盒說明書
微量法 100管/96樣
注 意 :正式測定前務(wù)必取2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定
測定意義:
MCA是線粒體三羧酸循環(huán)的第一個中間產(chǎn)物,由檸檬酸合酶催化乙酰CoA與草酰乙酸合成,其含量是三羧酸循環(huán)強(qiáng)度的主要指標(biāo)之一。
配合測定丙酮酸含量、丙酮酸脫氫酶活性、乙酰CoA含量、檸檬酸合酶活性和MCA含量,其中(1)丙酮酸含量和丙酮酸脫氫酶活性變化可以反映糖酵解進(jìn)行程度,(2)綜合分析丙酮酸含量、丙酮酸脫氫酶活性和乙酰CoA含量變化可以反映脂肪酸β-氧化途徑提供的乙酰CoA情況,(3)乙酰CoA含量、檸檬酸合酶活性和MCA含量變化可以反映三羧酸循環(huán)進(jìn)行狀況。
測定原理:
MCA在檸檬酸裂解酶的作用下,生成α-酮酸(草酰乙酸);在弱酸性條件下,α-酮酸進(jìn)一步與苯肼反應(yīng),生成相應(yīng)的α-酮酸苯腙;α-酮酸苯腙在330nm處有吸收峰,該波長下吸光度的變化程度可反映出MCA的含量。
自備儀器和用品:
分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、水浴鍋、可調(diào)式移液槍、微量石英比色皿/96孔板(UV板)、研缽、蒸餾水。
試劑組成和配制:
酸性提取液:液體100mL×1瓶,4℃保存。
堿性提取液:液體100mL×1瓶,4℃保存。
試劑一:液體6mL×1瓶,4℃保存。
試劑二:液體2mL×1瓶,4℃保存。
試劑三:粉劑×1瓶,4℃保存;臨用前加入6mL蒸餾水充分溶解待用;用不完的試劑4℃保存;
標(biāo)準(zhǔn)液:液體1mL×1支,10μmol/mL檸檬酸標(biāo)準(zhǔn)液,4℃保存。
線粒體中檸檬酸提取:
稱0.05~0.1g樣品(建議稱0.1g樣本),加入0.5mL酸性提取液,冰上充分研磨,600g/min 4℃離心5min;取上清至另一EP管中,11000g/min 4℃離心10min,棄上清(取300μL該上清液和300μL堿性提取液中和后可用于細(xì)胞質(zhì)CA含量測定);沉淀即線粒體,向沉淀中加入0.5mL酸性提取液,充分懸浮溶解,超聲波破碎(功率20%,超聲3秒,間隔10秒,重復(fù)30次),取此溶液300μL和300μL堿性提取液中和,混勻,置冰上待測(不可用于蛋白質(zhì)含量測定)。
測定步驟:
1、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30 min以上,調(diào)節(jié)波長到330nm,蒸餾水調(diào)零。
2、試劑一、二和三37℃預(yù)熱10min。
3、樣本測定:
空白管和標(biāo)準(zhǔn)管只需要各做一個。
試劑名稱(μL) | 空白管 | 標(biāo)準(zhǔn)管 | 測定管 |
試劑一 | 60 | 60 | 60 |
蒸餾水 | 60 | ||
標(biāo)準(zhǔn)液 | 60 | ||
樣本 | 60 | ||
試劑二 | 20 | 20 | 20 |
試劑三 | 60 | 60 | 60 |
充分混勻,330nm立即測定初始吸光值A1和37℃孵育30min后的吸光值A2,ΔA=A2 –A1。
檸檬酸含量計(jì)算:
(1)按蛋白濃度計(jì)算
檸檬酸含量(μmol/mg prot)=[C標(biāo)準(zhǔn)管×(ΔA測定管-ΔA空白管)÷(ΔA標(biāo)準(zhǔn)管-ΔA空白管) ×V樣]÷(V樣÷Cpr)=10×(ΔA測定管-ΔA空白管)÷(ΔA標(biāo)準(zhǔn)管-ΔA空白管)÷Cpr
蛋白質(zhì)含量需要另外測定。
(2)按樣本鮮重計(jì)算
檸檬酸含量(μ mol/g鮮重)=[C標(biāo)準(zhǔn)管×(ΔA測定管-ΔA空白管)÷(ΔA標(biāo)準(zhǔn)管-ΔA空白管) ×V樣]÷(W×V樣÷V樣總)=10×(ΔA測定管-ΔA空白管)÷(ΔA標(biāo)準(zhǔn)管-ΔA空白管)÷W
C標(biāo)準(zhǔn)管:標(biāo)準(zhǔn)液濃度,10μmol/mL; V樣:加入反應(yīng)體系中樣本體積:0.06mL;V樣總:加入提取液體積:1mL;Cpr:樣品蛋白濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g。
注意:Z低檢測限為10nmol/mg prot或1μmol/g鮮重。
電話
微信掃一掃