線粒體異檸檬酸脫氫酶(ICDHm)試劑盒說明書
微量法100管/96樣
注 意 :正式測定前務(wù)必取2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定
測定意義:
ICDHm(EC 1.1.1.41)廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞的線粒體中,在三羧酸循中催化異檸檬酸生成α-酮戊二酸,同時將NAD+ 還原為NADH,是三羧酸循環(huán)的限速酶之一,其催化的反應(yīng)是細(xì)胞NADH主要來源之一。
測定原理:
ICDHm催化NAD+ 還原生成NADH,導(dǎo)致340nm處光吸收上升。
需自備的儀器和用品
紫外分光光度計/酶標(biāo)儀、水浴鍋、臺式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。
試劑的組成和配制:
試劑一:100mL×1瓶,-20℃保存;
試劑二:20mL×1瓶,-20℃保存;
試劑三:1.5mL×1支,-20℃保存;
試劑四:液體20mL×1瓶,4℃保存;
試劑五:粉劑×1支,4℃保存;
試劑六:粉劑×1支,-20℃保存;
樣本的前處理:
組織、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離:
1、 稱取約0.1g組織或收集500萬細(xì)胞,加入1mL試劑一和10uL 試劑三,用冰浴勻漿器或研缽勻漿。
2、 將勻漿600g,4℃離心5min。
3、 棄沉淀,將上清液移至另一離心管中,11000g,4℃離心10min。
4、 上清液即胞漿提取物,可用于測定從線粒體泄漏的ICDHm(此步可選做)。
5、 在步驟④的沉淀中加入200uL試劑二和2uL 試劑三,超聲波破碎(冰浴,功率20%或200W,超聲3秒,間隔10秒,重復(fù)30次),用于線粒體ICDHm活性測定。
測定步驟:
1、 分光光度計或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長至340nm,蒸餾水調(diào)零。
2、 樣本測定
(1)在試劑五中加入18mL試劑四充分溶解,置于37℃(哺乳動物)或25℃(其它物種)水浴10min;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復(fù)凍融;
(2)在試劑六中加入1mL蒸餾水,充分溶解待用;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復(fù)凍融;
(3)在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本、10μL試劑六和180μL試劑五,混勻,立即記錄340nm處20s時的吸光值A1和 2min20s后的吸光值A2,計算ΔA=A2-A1。
ICDHm活性計算:
a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下
(1) 按樣本蛋白濃度計算
單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘生成1 nmol的NADH定義為一個酶活性單位。
ICDHm活性(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(Cpr×V樣) ÷T=1608×ΔA÷Cpr
(2) 按樣本鮮重計算
單位的定義:每g組織每分鐘生成1 nmol的NADH定義為一個酶活性單位。
ICDHm(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(W ×V樣÷V樣總) ÷T=325×ΔA÷W
(3) 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算
單位的定義:每1萬個細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘生成1 nmol的NADH定義為一個酶活性單位。
ICDHm活性(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=0.65×ΔA
V反總:反應(yīng)體系總體積,2×10-4 L;ε:NADH摩爾消光系數(shù),6.22×103 L / mol /cm;d:比色皿光徑,1cm;V樣:加入樣本體積,0.01 mL;V樣總:加入提取液體積,0.202 mL;T:反應(yīng)時間,2min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g;500:細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),500萬。
b.用96孔板測定的計算公式如下
(1) 按樣本蛋白濃度計算
單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘生成1 nmol的NADH定義為一個酶活性單位。
ICDHm活性(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=3216×ΔA÷Cpr
(2) 按樣本鮮重計算
單位的定義:每g組織每分鐘生成1 nmol的NADH定義為一個酶活性單位。
ICDHm(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(W× V樣÷V樣總)÷T=650×ΔA÷W
(3) 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算
單位的定義:每1萬個細(xì)菌或細(xì)胞在反應(yīng)體系中每分鐘生成1 nmol的NADH定義為一個酶活性單位。
ICDHm活性(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=1.3×ΔA
V反總:反應(yīng)體系總體積,2×10-4 L;ε:NADH摩爾消光系數(shù),6.22×103 L / mol /cm;d:96孔板光徑,0.5cm;V樣:加入樣本體積,0.01 mL;V樣總:加入提取液體積,0.202 mL;T:反應(yīng)時間,2min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g;500:細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),500萬。
電話
微信掃一掃