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羥甲基戊二酰輔酶A合成酶(HMGCS)試劑盒說明書

發(fā)布時間:2023/6/9      點擊次數(shù):272

羥甲基戊二酰輔酶A合成酶(HMGCS)試劑盒說明書

                                        微量法 100/96

 

   意 :正式測定前務(wù)必取2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義

羥甲基戊二酰輔酶A合成酶是甲羥戊酸代謝途徑中的關(guān)鍵酶,催化乙酰CoA與乙酰乙酰CoA生成羥甲基戊二酰CoA。

 

測定原理

HMGCS催化乙酰CoA與乙酰乙酰CoA生成羥甲基戊二酰CoA,同時產(chǎn)生CoASH,使DTNB轉(zhuǎn)化為黃色的TNB,在412nm下有特征吸光值。

 

所需的儀器和用品

可見分光光度計/酶標(biāo)儀、臺式離心機、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。

 

試劑的組成和配制

提取液:100mL×1瓶,4保存;

試劑一:粉劑×1瓶,-20避光保存;臨用前加入3mL蒸餾水充分溶解待用;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復(fù)凍融;

試劑二:粉劑×1瓶,-20避光保存;臨用前加入3mL蒸餾水充分溶解待用;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復(fù)凍融;

試劑三:6mL×1瓶,4避光保存。

 

樣本測定的準(zhǔn)備

1、細菌、細胞或組織樣品的制備:

細菌或培養(yǎng)細胞:先收集細菌或細胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;按照細菌或細胞數(shù)量(104個):提取液體積(mL)為500~10001的比例(建議500萬細菌或細胞加入1mL提取液),超聲波破碎細菌或細胞(冰浴,功率20%或200W,超聲3s,間隔10s,重復(fù)30次);8000g 4離心10min,取上清,置冰上待測。

組織:按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)15~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液),進行冰浴勻漿。8000g 4離心10min,取上清,置冰上待測。

2、血清(漿)樣品:直接檢測。

 

測定步驟

1、   分光光度計或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長至412nm,蒸餾水調(diào)零。

2、   在微量石英比色皿或96孔板中加入25μL試劑一、25μL試劑二和50μL試劑三,混勻,加入100μL樣本上清,迅速混勻后記錄412nm初始吸光值A14min后的吸光值A2。計算ΔAA2-A1

 

HMGCS活性計算

用微量石英比色皿測定的計算公式如下

 

1、血清(漿)活性

單位定義:每mL血清(漿)每分鐘催化產(chǎn)生1nmolTNB為一個酶活力單位。

HMGCSnmol/min /mL=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷V ÷T=36.76×ΔA

2、組織、細菌或細胞HMGCS活性

(1) 按樣本蛋白濃度計算

單位定義:每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1nmolTNB為一個酶活力單位。

HMGCSnmol/min /mg prot)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(V×Cpr) ÷T=36.76×ΔA÷Cpr

2)按樣本鮮重計算

單位定義:每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1nmolTNB為一個酶活力單位。

HMGCSnmol/min /g 鮮重)=[ΔA×V反總÷ε×d×109W ×V÷V樣總)÷T=36.76×ΔA÷W

3)按細菌或細胞密度計算

單位定義:每1萬個細菌或細胞每分鐘催化產(chǎn)生1nmolTNB為一個酶活力單位。

HMGCSnmol/min /104 cel)=[ΔA×V反總÷ε×d×109500×V÷V樣總)÷T=0.074×ΔA

V反總:反應(yīng)體系總體積,2×10-4 LεTNB摩爾消光系數(shù),1.36×104 L / mol /cmd:比色皿光徑,1cmV樣:加入樣本體積,0.1 mLV樣總:加入提取液體積,1mL;T:反應(yīng)時間,4 min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g500:細胞或細菌總數(shù),500萬。

 

96孔板測定的計算公式如下

1、血清(漿)活性

單位定義:每mL血清(漿)每分鐘催化產(chǎn)生1nmolTNB為一個酶活力單位。

HMGCSnmol/min /mL=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷V ÷T=73.53×ΔA

2、組織、細菌或細胞HMGCS活性

(1) 按樣本蛋白濃度計算

單位定義:每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1nmolTNB為一個酶活力單位。

HMGCSnmol/min /mg prot)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(V×Cpr) ÷T=73.53×ΔA÷Cpr

2)按樣本鮮重計算

單位定義:每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1nmolTNB為一個酶活力單位。

HMGCSnmol/min /g 鮮重)=[ΔA×V反總÷ε×d×109W ×V÷V樣總)÷T=73.53×ΔA÷W

3)按細菌或細胞密度計算

單位定義:每1萬個細菌或細胞每分鐘催化產(chǎn)生1nmolTNB為一個酶活力單位。

HMGCSnmol/min /104 cel)=[ΔA×V反總÷ε×d×109500×V÷V樣總)÷T=0.147×ΔA

V反總:反應(yīng)體系總體積,2×10-4 LεTNB摩爾消光系數(shù),1.36×104 L / mol /cmd96孔板光徑,0.5cm;V樣:加入樣本體積,0.1 mLV樣總:加入提取液體積,1 mL;T:反應(yīng)時間,4 min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g;500:細胞或細菌總數(shù),500萬。


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