丙酮酸脫氫酶(Pyruvate dehydrogenase,PDH)試劑盒說明書
微量法100管/96樣
注 意 :正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定
測(cè)定意義:
PDH(EC 1.2.4.1)廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中,是丙酮酸脫氫酶復(fù)合體(PDHC)催化丙酮酸氧化脫羧的限速酶,催化丙酮酸脫梭生成羥乙-基-TPP,把糖酵解和三羧酸循環(huán)連接起來。
測(cè)定原理:
PDH催化丙酮酸脫氫,同時(shí)還原2,6-二氯酚靛酚(2,6-DCPIP),從而導(dǎo)致600nm光吸收的減少。
需自備的儀器和用品
可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。
試劑的組成和配制:
試劑一:100mL×1瓶,-20℃保存;
試劑二:20mL×1瓶,-20℃保存;
試劑三:1.5mL×1支,-20℃保存;
試劑四:液體20mL×1瓶,4℃保存;
試劑五:粉劑×1瓶,4℃保存;
樣本的前處理:
組織、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離:
1、 稱取約0.1g組織或收集500萬細(xì)胞,加入1mL試劑一和10uL 試劑三,用冰浴勻漿器或研缽勻漿。
2、 將勻漿600g,4℃離心5min。
3、 棄沉淀,將上清液移至另一離心管中,11000g,4℃離心10min。
4、 上清液即胞漿提取物,可用于測(cè)定從線粒體泄漏的PDH(此步可選做)。
5、 在步驟④的沉淀中加入200uL試劑二和2uL 試劑三,超聲波破碎(冰浴,功率20%或200W,超聲3秒,間隔10秒,重復(fù)30次),用于線粒體PDH活性測(cè)定。
測(cè)定步驟:
1、 分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長至605nm,蒸餾水調(diào)零。
2、 樣本測(cè)定
(1)在試劑五中加入19mL試劑四充分溶解,置于37℃(哺乳動(dòng)物)或25℃(其它物種)水浴10min;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復(fù)凍融;
(2)在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本和190μL試劑五,混勻,立即記錄605nm處初始吸光值A1和 1min后的吸光值A2,計(jì)算ΔA=A1-A2。
PDH活性計(jì)算:
a.用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下
(1) 按樣本蛋白濃度計(jì)算
單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個(gè)酶活性單位。
PDH活性(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=952×ΔA÷Cpr
(2) 按樣本鮮重計(jì)算
單位的定義:每g組織每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個(gè)酶活性單位。
PDH活性(nmol/min /g 鮮重)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T=192×ΔA÷W
(3) 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算
單位的定義:每1萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個(gè)酶活性單位。
PDH活性(nmol/min /104 cell)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=0.385×ΔA
V反總:反應(yīng)體系總體積,2×10-4 L;ε:2,6-二氯吲哚酚摩爾消光系數(shù),2.1×104 L / mol /cm;d:比色皿光徑,1cm;V樣:加入樣本體積,0.01 mL;V樣總:加入提取液體積,0.202 mL;T:反應(yīng)時(shí)間,1 min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g;500:細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),500萬。
b.用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下
(1) 按樣本蛋白濃度計(jì)算
單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個(gè)酶活性單位。
PDH活性(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=1904×ΔA÷Cpr
(2) 按樣本鮮重計(jì)算
單位的定義:每g組織每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個(gè)酶活性單位。
PDH活性(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(W× V樣÷V樣總)÷T=384×ΔA÷W
(3) 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算
單位的定義:每1萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個(gè)酶活性單位。
PDH活性(nmol/min /104 cell)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=0.77×ΔA
V反總:反應(yīng)體系總體積,2×10-4 L;ε:2,6-二氯吲哚酚摩爾消光系數(shù),2.1×104 L / mol /cm;d:96孔板光徑,0.5cm;V樣:加入樣本體積,0.01 mL;V樣總:加入提取液體積,0.202 mL;T:反應(yīng)時(shí)間,1 min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g;500:細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),500萬。
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