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蔗糖酶(sucrase)試劑盒說明書

發(fā)布時間:2023/6/1      點擊次數(shù):292

蔗糖酶(sucrase)試劑盒說明書

                                       微量法100/48

 

 

 

   意 :正式測定前務(wù)必取2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義:

蔗糖酶(EC 3.2.1.26是碳水化合物消化吸收的關(guān)鍵酶之一,能夠水解蔗糖變成相應(yīng)的單糖而被機體吸收。

 

測定原理:

本試劑盒采用3.5-二硝基水楊酸法測定蔗糖酶催化產(chǎn)生的還原糖的含量,由此可得出蔗糖酶水解速度。其原理是3.5-二硝基水楊酸與還原糖共熱被還原成棕紅色的氨基化合物,在一定范圍內(nèi)還原糖的量和反應(yīng)液的顏色深度成正比。此法操作簡便、迅速、雜質(zhì)干擾較小。

 

所需的儀器和用品:

可見分光光度計/酶標(biāo)儀、沸水浴、移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。

 

試劑的組成和配制:

提取液:液體100mL×1瓶,4保存;

試劑一:液體2mL×1瓶,4保存;
試劑二:粉劑×1 ,4保存,用時加入1mL蒸餾水充分溶解待用;用不完的試劑4保存;

試劑三:液體3mL×1瓶,常溫保存;

 

樣品測定的準(zhǔn)備:

按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)15~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液),進行冰浴勻漿。8000g 4離心10min,取上清,置冰上待測。

 

測定步驟:

1、   分光光度計或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長至520nm,蒸餾水調(diào)零。

2、   樣本測定,(在EP管中依次加入下列試劑):

試劑名稱(μL

對照管

測定管

試劑一

15

15

蒸餾水

15


樣本

30

30

試劑二


15

置于25準(zhǔn)確水浴10min

試劑三

30

30

混勻, 95水浴5min左右(蓋緊,防止水分散失),冷卻至室溫

蒸餾水

210

210

 

混勻,200μL至微量石英比色皿或96孔板中測定各管520nm吸光值,ΔA=A測定-A對照,每個測定管需設(shè)一個對照管。

 

蔗糖酶活力計算:

a. 用微量石英比色皿測定的計算公式如下

1、標(biāo)準(zhǔn)條件下測定的回歸方程為y = 0.1296x -0.12;x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度(mg/mL),y為吸光值。

2、按照蛋白濃度計算

單位定義:每mg組織蛋白每分鐘催化水解1μg蔗糖定義為一個酶活力單位。

蔗糖酶活力(μg/min/mg prot)=[1000×(ΔA+0.12)÷0.1296×V1]÷(V1×Cpr)÷T=771×(ΔA +0.12)÷Cpr。

3、按樣本鮮重計算

單位定義:每g組織每分鐘催化水解1μg蔗糖定義為一個酶活力單位。

蔗糖酶活力(μg/min/g鮮重)=[1000×(ΔA+0.12)÷0.1296×V1]÷(W×V1÷V2)÷T=771×(ΔA +0.12) ÷W

10001mg/mL=1000μg/mL;V1:加入反應(yīng)體系中樣本體積,0.03mL;V2:加入提取液體積,1mL;T:反應(yīng)時間,10min; Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mLW:樣本鮮重,g。

 

b. 96孔板測定的計算公式如下

1、標(biāo)準(zhǔn)條件下測定的回歸方程為y = 0.0648x -0.12;x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度(mg/mL),y為吸光值。

2、按照蛋白濃度計算

單位定義:每mg組織蛋白每分鐘催化水解1μg 蔗糖定義為一個酶活力單位。

蔗糖酶活力(μg/min/mg prot)=[1000×(ΔA+0.12)÷0.0648×V1]÷(V1×Cpr)÷T=1542×(ΔA +0.12)÷Cpr。

3、按樣本鮮重計算

單位的定義:每g組織每分鐘催化水解1μg 蔗糖定義為一個酶活力單位。

蔗糖酶活力(μg/min/g鮮重)=[1000×(ΔA+0.12)÷0.0648×V1]÷(W×V1÷V2)÷T=1543×(ΔA +0.12) ÷W。

10001mg/mL=1000μg/mLV1:加入反應(yīng)體系中樣本體積,0.03mLV2:加入提取液體積,1mLT:反應(yīng)時間,10min Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mLW:樣本鮮重,g。


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