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蔗糖磷酸化酶(Sucrose Phosphorylase, SP)試劑盒說明書

發(fā)布時間:2023/6/1      點(diǎn)擊次數(shù):265

蔗糖磷酸化酶Sucrose Phosphorylase, SP試劑盒說明書

                                                     微量法100T/96S

 

 

   :正式測定之前選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。

測定意義:

SP(EC2.4.1.7)主要存在于微生物和植物中,裂解葡萄糖苷鍵,催化葡萄糖基轉(zhuǎn)移到果糖、木糖、半乳糖和鼠李糖等,合成相應(yīng)的葡萄糖基低聚糖。此外,SP還能催化氫醌合成熊果苷,具有很強(qiáng)的美白效果,在化妝品工業(yè)中具有重要應(yīng)用。

 

測定原理:

SP能夠以磷酸為受體,催化蔗糖產(chǎn)生1-磷酸葡萄糖,在葡萄糖磷酸變位酶催化下變位為6-磷酸葡萄糖,在6-磷酸葡萄糖脫氫酶作用下還原NADP+生成NADPH,導(dǎo)致340nm光吸收值增加。測定340nm吸光度增加速率,即可計算SP活性。

 

自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器:

天平、低溫離心機(jī)、恒溫水浴鍋、酶標(biāo)儀、96孔板和蒸餾水。

 

試劑組成和配制:

提取液:液體100mL×1瓶,4℃保存。

試劑一:液體15mL×1瓶,4℃保存。

試劑二:粉劑×1支,-20℃避光保存,臨用前加2.5mL蒸餾水溶解;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復(fù)凍融。

試劑三:粉劑×1支,-20℃避光保存,臨用前加5mL蒸餾水溶解;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復(fù)凍融。

 

粗酶液提?。?/span>

1.        組織:按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)15~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液)進(jìn)行冰浴勻漿,然后10000g4℃,離心10min,取上清待測。

2.        細(xì)菌、真菌:按照細(xì)胞數(shù)量(104個):提取液體積(mL)為500~10001的比例(建議500萬細(xì)胞加入1mL提取液),冰浴超聲波破碎細(xì)胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時間3min);然后10000g4℃,離心10min,取上清置于冰上待測。

 

測定操作表:

1.酶標(biāo)儀預(yù)熱30min,調(diào)節(jié)波長至340nm

2.操作表

試劑名稱

對照管

測定管

試劑一(μL

120

120

試劑二(μL

20

20

試劑三(μL

40

40

樣本(μL


20

蒸餾水(μL

20


迅速混勻,于96孔板,37℃下測定340nm的初始吸光值與反應(yīng)2min后的吸光值,測定管記作A1A2,對照管記作A3A4,△A=A2- A1-A4-   A3)。

 

SP活性計算公式:

1. 按照蛋白濃度計算

酶活定義:37℃,pH6.8時,每毫克蛋白質(zhì)每分鐘催化產(chǎn)生1nmol NADPH為一個酶活單位。

SP活性(nmol/min/mg prot=×V反總÷V÷Cpr÷T=1608×△A÷Cpr

2.        按照樣本質(zhì)量計算

酶活定義:37℃,pH6.8時,每克樣本每分鐘催化產(chǎn)生1nmol NADPH為一個酶活單位。

SP活性(nmol/min/g 鮮重)=×V反總÷(V÷V樣總×W)÷T=1608×△A÷W

3. 按照細(xì)胞數(shù)量計算

酶活定義:37℃pH6.8時,每104個細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生1nmol NADPH為一個酶活單位。

SP活性(nmol/min/104 cell=×V反總÷(V÷V樣總×細(xì)胞數(shù)量(萬個))÷T=1608×△A÷細(xì)胞數(shù)量(萬個)

NADPH摩爾消光系數(shù),6220 L/mol/cm;d:比色皿光徑,0.5cmV反總:反應(yīng)體系總體積,0.2mLV樣:反應(yīng)體系中樣本體積,0.02mLW:樣本質(zhì)量,gCpr:蛋白濃度,mg/mL;V樣總:加入提取液體積,1mL;T:反應(yīng)時間,2min

 

注意事項(xiàng):

1.        可選用BCA法測定蛋白含量試劑盒測定蛋白含量。

2.        樣本較多時,可以按照每個樣本試劑一:試劑二:試劑三=1202040μL)的比例配制工作液,用多少配多少,臨用前立刻配制,10分鐘內(nèi)使用。


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