蔗糖合成酶(合成方向;SS-Ⅱ)試劑盒說(shuō)明書
微量法100管/48樣
注 意 :正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定
測(cè)定意義:
蔗糖是源(葉片等)光合產(chǎn)物向“庫(kù)"器官運(yùn)輸?shù)闹饕螒B(tài)。蔗糖合成酶(Sucrose Synthase, EC 2.4.1.13)是雙向反應(yīng)酶,既可催化蔗糖合成又可催化蔗糖分解,是蔗糖代謝的關(guān)鍵酶之一。研究其合成方向SS-Ⅱ的活性對(duì)于植物蔗糖合成具有重要意義。
測(cè)定原理:
SS-Ⅱ催化游離果糖與葡萄糖供體UDPG反應(yīng)生成蔗糖,蔗糖與間苯二酚反應(yīng)可呈現(xiàn)顏色變化,在480nm下有特征吸收峰,酶活力大小與顏色的深淺成正比。
需自備的儀器和用品:
可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、水浴鍋、離心機(jī)、移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰
試劑的組成和配制:
提取液:液體100mL×1瓶,4℃保存;
試劑一:液體2.5mL×1瓶,-20℃保存;
試劑二:1000μg/mL蔗糖溶液10mL×1瓶,4℃保存;
試劑三:液體2mL×1瓶,4℃保存
試劑四:液體25mL×1瓶,4℃保存;
試劑五:液體6mL×1瓶,4℃避光保存;
樣品測(cè)定的準(zhǔn)備:
按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液),進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測(cè)。
測(cè)定步驟:
1、 分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至480nm,蒸餾水調(diào)零。
2、 樣本測(cè)定,(在EP管中依次加入下列試劑):
試劑名稱(μL) | 測(cè)定管 | 對(duì)照管 | 標(biāo)準(zhǔn)管 | 空白管 |
樣本 | 10 | 10 | ||
蒸餾水 | 45 | 45 | 55 | |
試劑二 | 10 | |||
試劑一 | 45 |
混勻,25℃準(zhǔn)確水浴10min
試劑三 | 15 | 15 | 15 | 15 |
沸水浴中煮沸10min左右(蓋緊,以防止水分散失),冷卻
試劑四 | 210 | 210 | 210 | 210 |
試劑五 | 60 | 60 | 60 | 60 |
混勻,沸水浴30min,冷卻后,取200μL 至微量石英比色皿或96孔板中,480nm下測(cè)定各管吸光值。標(biāo)準(zhǔn)管和空白管只要做一管。每個(gè)測(cè)定管需要設(shè)一個(gè)對(duì)照管。
SS-Ⅱ活性計(jì)算:
1、按照蛋白濃度計(jì)算
單位定義:每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1μg 蔗糖定義為一個(gè)酶活力單位。
SS-Ⅱ活性(μg /min/mg prot)= C標(biāo)準(zhǔn)管×V1×(A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)÷(V1×Cpr)÷T=100×(A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)÷Cpr
2、按照樣本鮮重計(jì)算
單位定義:每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1μg 蔗糖定義為一個(gè)酶活力單位。
SS-Ⅱ活性(μg /min/g鮮重) = C標(biāo)準(zhǔn)管×V1×(A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)÷(W×V1÷V2)÷T=100×(A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)÷W
C標(biāo)準(zhǔn)管:標(biāo)準(zhǔn)管濃度,1000μg/mL;V1:加入反應(yīng)體系中樣本體積,0.01mL; V2:加入提取液體積,1mL;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本鮮重,g;T :反應(yīng)時(shí)間:10min。
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