蔗糖合成酶(分解方向;SS-Ⅰ)試劑盒說明書
微量法100管/48樣
注 意 :正式測定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定
測定意義:
蔗糖是源(葉片等)光合產(chǎn)物向“庫"器官運(yùn)輸?shù)闹饕螒B(tài)。蔗糖合成酶(Sucrose Synthase, EC 2.4.1.13)是雙向反應(yīng)酶,既可催化蔗糖合成又可催化蔗糖分解,是蔗糖代謝的關(guān)鍵酶之一。研究其分解方向SS-Ⅰ的活性對于植物蔗糖降解以及淀粉合成具有重要意義。
測定原理:
SS-Ⅰ催化蔗糖和UDP生成游離果糖和UDPG,采用3,5-二硝基水楊酸法測定還原糖的含量來反映酶活性的高低。
需自備的儀器和用品:
可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、水浴鍋、離心機(jī)、移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰
試劑的組成和配制:
提取液:液體100mL×1瓶,4℃保存;
試劑一:液體10mL×1瓶,4℃保存;
試劑二: 液體5mL×1瓶,4℃保存;
試劑三:粉劑×2支,-20℃保存;臨用前每支加入1.2mL試劑二充分溶解待用,現(xiàn)配現(xiàn)用;
試劑四:液體6mL×1瓶,4℃保存。
樣品測定的準(zhǔn)備:
按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液),進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。
測定步驟:
1、 分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長至540nm,蒸餾水調(diào)零。
2、 樣本測定,(在EP管中依次加入下列試劑):
試劑名稱(μL) | 測定管 | 對照管 |
樣本 | 10 | 10 |
試劑三 | 40 | |
試劑一 | 40 |
混勻,30℃準(zhǔn)確水浴30min后,95℃水浴10min
試劑四 | 50 | 50 |
95℃水浴5min左右,冷卻至室溫
蒸餾水 | 400 | 400 |
混勻,取200μL 至微量石英比色皿或96孔板中,540nm下測定各管
吸光值。ΔA=A測定-A對照。每個(gè)測定管需要設(shè)一個(gè)對照管。
SS-Ⅰ活性計(jì)算:
a.用微量石英比色皿測定的計(jì)算公式如下
1、標(biāo)準(zhǔn)條件下測定回歸方程為y = 0.0012x - 0.0492;x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度(μg/mL),y為ΔA。
2、按照蛋白濃度計(jì)算
單位定義:每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1μg 還原糖定義為一個(gè)酶活力單位。
SS-Ⅰ活性(μg /min/mg prot)= (ΔA+0.0492) ÷0.0012×V反總]÷(V樣×Cpr) ÷T
=138.9×(ΔA+0.0492) ÷Cpr
3、按照樣本鮮重計(jì)算
單位定義:每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1μg 還原糖定義為一個(gè)酶活力單位。
SS-Ⅰ活性(μg /min/g鮮重) =(ΔA+0.0492) ÷0.0012×V反總]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T
=138.9×(ΔA+0.0492) ÷W
V反總:反應(yīng)體系總體積,0.05mL; V樣:加入樣本體積,0.01 mL;V樣總:加入提取液體積,1 mL;T:反應(yīng)時(shí)間,30 min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g。
b.用96孔板測定的計(jì)算公式如下
1、標(biāo)準(zhǔn)條件下測定回歸方程為y = 0.0006x - 0.0492;x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度(μg/mL),y為ΔA。
2、按照蛋白濃度計(jì)算
單位定義:每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1μg 還原糖定義為一個(gè)酶活力單位。
SS-Ⅰ活性(μg /min/mg prot)= (ΔA+0.0492) ÷0.0006×V反總]÷(V樣×Cpr) ÷T
=277.8×(ΔA+0.0492) ÷Cpr
3、按照樣本鮮重計(jì)算
單位定義:每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1μg 還原糖定義為一個(gè)酶活力單位。
SS-Ⅰ活性(μg /min/g鮮重) =(ΔA+0.0492) ÷0.0006×V反總]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T
=277.8×(ΔA+0.0492) ÷W
V反總:反應(yīng)體系總體積,0.05mL; V樣:加入樣本體積,0.01 mL;V樣總:加入提取液體積,1 mL;T:反應(yīng)時(shí)間,30 min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g。
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