肉毒堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶(CPT-1)試劑盒說明書
微量法100管/96樣
注 意 :正式測定前務(wù)必取2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定
測定意義:
肉毒堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶是存在于線粒體內(nèi)膜的一類酰基轉(zhuǎn)移酶。可逆地催化從?;o酶A將?;D(zhuǎn)移至L-肉毒堿的反應(yīng),在轉(zhuǎn)運(yùn)脂肪酸通過線粒體內(nèi)膜的過程中起重要作用。
測定原理:
基于肉堿和脂酰輔酶A在丙二酰輔酶A存在與否的條件下,通過肉堿脂酰轉(zhuǎn)移酶(CPT-I)的作用,產(chǎn)生脂酰肉堿,并釋放出巰基輔酶A(COA-SH),與Ellman試劑DN-TB反應(yīng)后,產(chǎn)生黃色的TNB。通過其吸收峰值得變化(412nm),來定量分析CPT-1的活性。
需自備的儀器和用品:
可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰、無水乙醇和蒸餾水
試劑組成和配制:
試劑一:液體100mL×1瓶,-20℃保存;
試劑二:液體20mL×1瓶,-20℃保存;
試劑三:液體1.5mL×1支,-20℃保存;
試劑四:液體30mL×1瓶,4℃保存;
試劑五:粉劑×1瓶,4℃保存;
試劑六:粉劑×1支,-20℃保存;
樣本的前處理:
組織、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離:
① 稱取約0.1g組織或收集500萬細(xì)胞,加入1mL試劑一和10uL 試劑三,用冰浴勻漿器或研缽勻漿。
② 將勻漿液于600g,4℃離心5min。
③ 棄沉淀,將上清液移至另一離心管中,11000g,4℃離心10min。
④ 上清液即胞漿提取物,可用于測定從線粒體泄漏的CPT-1(此步可選做)。
⑤ 在步驟④的沉淀中加入200uL試劑二和2uL 試劑三,超聲波破碎(冰浴,功率20%或200W,超聲3秒,間隔10秒,重復(fù)30次),用于線粒體CPT-1測定。
測定步驟:
1、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長至412nm,蒸餾水調(diào)零。
2、樣本測定
(1)在試劑五中加入1mL無水乙醇,混勻,再加入22mL試劑四,混勻,37℃(哺乳動物)或25℃(其它物種)孵育5min;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復(fù)凍融;
(2)在試劑六中加入1mL蒸餾水,混勻,37℃(哺乳動物)或25℃(其它物種)孵育5min;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復(fù)凍融;
(3)在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本、220μL試劑五和10μL試劑六,混勻,記錄412nm處20秒時的初始吸光度A1和2分20秒時的吸光度A2,計(jì)算ΔA=A2-A1。
CPT-1活性計(jì)算:
a. 使用微量石英比色皿測定的計(jì)算公式如下:
(1)按樣本蛋白濃度計(jì)算:
單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1 nmol TNB定義為一個酶活力單位。
CPT-1(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=880×ΔA÷Cpr
此法需要自行測定樣本蛋白質(zhì)濃度。
(2)按樣本鮮重計(jì)算:
單位的定義:每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1 nmol TNB定義為一個酶活力單位。
CPT-1(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(W× V樣÷V樣總)÷T=177.8×ΔA÷W
(3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算:
單位的定義:每1萬個細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生1 nmol TNB定義為一個酶活力單位。
CPT-1(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=0.3556×ΔA
V反總:反應(yīng)體系總體積,2.4×10-4 L;ε:TNB摩爾消光系數(shù),1.36×104 L / mol /cm;d:比色皿光徑,1cm;V樣:加入樣本體積,0.01 mL;V樣總:加入提取液體積,0.202 mL;T:反應(yīng)時間,2 min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g;500:細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù),500萬。
b. 使用96孔板測定的計(jì)算公式如下:
(1)按樣本蛋白濃度計(jì)算:
單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1 nmol TNB定義為一個酶活力單位。
CPT-1(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=1760×ΔA÷Cpr
此法需要自行測定樣本蛋白質(zhì)濃度。
(2)按樣本鮮重計(jì)算:
單位的定義:每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1 nmol TNB定義為一個酶活力單位。
CPT-1(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(W ×V樣÷V樣總)÷T=355.6×ΔA÷W
(3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算:
單位的定義:每1萬個細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生1 nmol TNB定義為一個酶活力單位。
CPT-1(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=0.711×ΔA
V反總:反應(yīng)體系總體積,2.4×10-4 L;ε:TNB摩爾消光系數(shù),1.36×104 L / mol /cm;d:96孔板光徑,0.5cm;V樣:加入樣本體積,0.01 mL;V樣總:加入提取液體積,0.202 mL;T:反應(yīng)時間,2 min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g;500:細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù),500萬。
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