乙酰輔酶A羧化酶(Acetyl-CoA carboxylase,ACC)試劑盒說明書
微量法100管/48樣
注 意 :正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定
測(cè)定意義:
ACC在生物體內(nèi)催化乙酰輔酶A羧化生成丙二酰輔酶A,是脂肪酸和許多次生代謝產(chǎn)物合成的關(guān)鍵酶。ACC的活性在一定程度上決定了脂肪酸的合成速度和含油量的高低。
測(cè)定原理:
ACC能夠催化乙酰輔酶A、NaHCO3和ATP生成丙二酰輔酶A、ATP和無機(jī)磷,通過鉬酸銨定磷法測(cè)定無機(jī)磷的增加量來測(cè)定ACC活性。
需自備的儀器和用品:
分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、恒溫水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。
試劑的組成:
提取液:100mL×1瓶,4℃保存;
試劑一:10mL×1瓶, 4℃保存;
試劑二:粉劑×1瓶,4℃保存;
試劑三:粉劑×1瓶,-20℃保存;
試劑四:粉劑×1 瓶, 4℃保存。用時(shí)加入25mL蒸餾水,溶解后4℃可保存一周。
試劑五:粉劑×1瓶, 4℃保存。用時(shí)加入25mL蒸餾水,溶解后4℃可保存一周。
試劑六:液體 25mL×1 瓶,室溫保存。
試劑七:10μmol/mL 標(biāo)準(zhǔn)磷貯備液 10mL×1 瓶,4℃保存。
樣本的前處理:
1、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞:先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量(104個(gè)):提取液體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液),超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞(冰浴,功率20%或200W,超聲3s,間隔10s,重復(fù)30次);8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測(cè)。
2、組織:按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液),進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測(cè)。
測(cè)定步驟:
1、 分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長至660nm,蒸餾水調(diào)零。
2、 酶促反應(yīng)試劑的配制和預(yù)熱:在試劑二瓶中加入2.5mL試劑一,充分溶解混勻;在試劑三瓶中加入2mL蒸餾水,充分溶解混勻;將試劑一、二、三在37℃(哺乳動(dòng)物)或25℃(其它物種)預(yù)熱10分鐘。
3、定磷試劑的配制:按H2O: 試劑四:試劑五:試劑六=2:1:1:1 的比例配制,配好的定磷試劑
應(yīng)為淺黃色,若無色則試劑失效,若是藍(lán)色則為磷污染,定磷劑現(xiàn)用現(xiàn)配。
注意:配試劑最好用新的燒杯、玻棒和玻璃移液器,也可以用一次性塑料器皿,避免磷污染。
4、0.5μmol/mL 標(biāo)準(zhǔn)磷應(yīng)用液配制:將試劑七20倍稀釋,即取 0.5mL試劑七加9.5蒸餾水,充分混勻。
5、酶促反應(yīng)
試劑名稱(μL) | 對(duì)照管 | 測(cè)定管 |
試劑一 | 90 | |
試劑二 | 50 | |
試劑三 | 40 | |
樣本 | 10 | 10 |
37℃(哺乳動(dòng)物)或25℃(其它物種)準(zhǔn)確反應(yīng)30min后,90℃水浴5min(蓋緊,以防止水分散失),冷卻后,10000g 25℃離心5min,取上清
6、定磷
標(biāo)準(zhǔn)管 | 空白管 | 對(duì)照管 | 測(cè)定管 | |
0.5μmol/mL標(biāo)準(zhǔn)磷應(yīng)用液 | 20 | |||
蒸餾水 | 20 | |||
上清液 | 20 | 20 | ||
定磷試劑 | 180 | 180 | 180 | 180 |
混勻,37℃(哺乳動(dòng)物)或25℃(其它物種)保溫30min,冷卻至室溫,在 660nm處,蒸餾水調(diào)零,記錄各管吸光值A。標(biāo)準(zhǔn)管、空白管只要做一次即可,每個(gè)測(cè)定管需要設(shè)一個(gè)對(duì)照管。
注意:若測(cè)定管吸光值大于2,將樣品用提取液稀釋適當(dāng)倍數(shù)后再進(jìn)行測(cè)定,使吸光值小于2,可提高檢測(cè)靈敏度,計(jì)算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)。
ACC活性計(jì)算:
1、按組織蛋白濃度計(jì)算:
定義:每小時(shí)每毫克組織蛋白產(chǎn)生1μmol無機(jī)磷的量為一個(gè) ACC活力單位。
ACC (μmol/h/mg prot)=(C標(biāo)準(zhǔn)管×V總)×(A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)÷
(V樣×Cpr)÷T=10×(A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)÷Cpr
2、按樣本鮮重計(jì)算:
定義:每小時(shí)每g組織產(chǎn)生1μmol無機(jī)磷的量為一個(gè) ACC活力單位。
ACC (μmol/h /g鮮重)=(C標(biāo)準(zhǔn)管×V總)×(A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)×V總÷
(W× V樣÷V樣總)÷T=10×(A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)÷W
3、 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算:
定義:每小時(shí)每500萬細(xì)菌或細(xì)胞產(chǎn)生1μmol無機(jī)磷的量為一個(gè) ACC活力單位。
ACC (U/104 cell)=(C標(biāo)準(zhǔn)管×V總)×(A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)×V總÷
(500× V樣÷V樣總)÷T=0.02×(A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)
C標(biāo)準(zhǔn)管:標(biāo)準(zhǔn)管濃度,0.5μmol/mL;V總:酶促反應(yīng)總體積,0.1mL;V樣:加入樣本體積,0.01mL ;V樣總:加入提取液體積,1mL;T:反應(yīng)時(shí)間,0.5小時(shí);Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本鮮重,g;500:細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),500萬。
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