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磷脂酶D( Phospholipases D,PLD )試劑盒說明書

發(fā)布時間:2023/5/12      點(diǎn)擊次數(shù):256

磷脂酶D Phospholipases DPLD )試劑盒說明書

微量法100T/96S

 

 

   :正式測定之前選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。

測定意義:

磷脂酶DEC3.1.4.4)即磷脂酰膽堿水解酶,是催化磷酸二酯鍵水解和堿基交換反應(yīng)的一類酶的總稱,廣泛存在于高等動植物和細(xì)菌等多種生物體中,具有參與細(xì)胞脂質(zhì)代謝、信號傳導(dǎo)、生物膜形成的抗逆境脅等生理功能。

 

測定原理:

磷脂酶D催化水解磷脂酰膽堿末端的磷脂酰二酯鍵生成磷脂酸和膽堿,膽堿在膽堿氧化酶催化作用下生成甜菜堿和過氧化氫,過氧化氫在過氧化氫酶的作用下將4-氨基安替比林和重蒸酚氧化成粉紅色物質(zhì),在500nm處有特征吸收峰。

 

自備實(shí)驗用品及儀器:

天平、研缽、超速冷凍離心機(jī)、可見分光光度計/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板、恒溫水浴鍋、無水乙醇。

 

試劑組成和配制:

提取液:液體100mL×1瓶,4℃保存。

試劑一:液體102mL×瓶,4℃避光保存。

試劑二:液體3mL×1瓶,4℃避光保存。

試劑三:粉劑×1支,-20℃避光保存。臨用前加1mL無水乙醇充分溶解;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復(fù)凍融。

試劑四:液體15mL×1瓶,4℃避光保存。

標(biāo)準(zhǔn)品:液體1mL×1支,4℃避光保存。

 

酶液提?。?/span>

1.        組織:按照質(zhì)量(g):提取液體積(mL)15~10的比例(建議稱取約0.1g,加入1mL提取液)加入提取液,冰浴勻漿后于4℃,10000g離心5min,取全部上清于4℃、100000g離心30min,棄上清,取沉淀溶于1mL試劑一。

2.        細(xì)胞:按照細(xì)胞數(shù)量(104個):提取液體積(mL)為500~10001的比例(建議500萬細(xì)胞加入1mL提取液),冰浴超聲波破碎細(xì)胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時間3min);然后4℃,10000g離心5min,取全部上清于4℃、100000g離心30min,棄上清,取沉淀溶于1mL試劑一。

3.        血清:直接測定。                  

 

測定操作:


空白管

標(biāo)準(zhǔn)管

測定管

試劑一(μL

20



試劑二(μL

30

30

30

標(biāo)準(zhǔn)品(μL


20


樣品(μL



20

試劑三(μL

10

10

10

充分混勻,30℃反應(yīng)30min,沸水浴1min,打開蓋子,自然冷卻2min。

試劑四(μL

140

140

140

30℃反應(yīng)30min,于微量石英比色皿/96孔板,空白管調(diào)零,測定500nm處吸光值,分別記為A標(biāo)準(zhǔn)管和A測定管。

 

 

酶活計算公式

a. 用微量石英比色皿測定的計算公式如下

1.按照蛋白濃度計算

酶活性定義:每毫克蛋白每分鐘水解磷脂酰膽堿產(chǎn)生1nmol膽堿所需的酶量為一個酶活力單位。

PLD活性(nmol/min /mg prot= ×C標(biāo)準(zhǔn)÷Cpr÷T= 16.7×÷Cpr

2.按照樣本質(zhì)量計算

酶活性定義:每克組織每分鐘水解磷脂酰膽堿產(chǎn)生1nmol膽堿所需的酶量為一個酶活力單位。

PLD活性(nmol/min /g 鮮重)=  ×C標(biāo)準(zhǔn)÷W÷T = 16.7×÷W

3.按照細(xì)胞數(shù)量計算

酶活性定義:104個細(xì)胞每分鐘水解磷脂酰膽堿產(chǎn)生1nmol膽堿所需的酶量為一個酶活力單位。

PLD活性(nmol/min /104 cell= ×C標(biāo)準(zhǔn)÷細(xì)胞數(shù)量÷T = 16.7×÷細(xì)胞數(shù)量

4.按照液體體積計算

酶活性定義:每毫升血清每分鐘水解磷脂酰膽堿產(chǎn)生1nmol膽堿所需的酶量為一個酶活力單位。

PLD活性(nmol/min /mL=  ×C標(biāo)準(zhǔn)÷T=16.7×

C標(biāo)準(zhǔn):標(biāo)準(zhǔn)品濃度,500nmol/mL;Cpr:樣本蛋白濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g/mL;T:反應(yīng)時間,30min

b.        96孔板測定的計算公式如下

1.按照蛋白濃度計算

酶活性定義:每毫克蛋白每分鐘水解磷脂酰膽堿產(chǎn)生1nmol膽堿所需的酶量為一個酶活力單位。

PLD活性(nmol/min /mg prot= ×C標(biāo)準(zhǔn)÷Cpr÷T= 16.7×÷Cpr

2.按照樣本質(zhì)量計算

酶活性定義:每克組織每分鐘水解磷脂酰膽堿產(chǎn)生1nmol膽堿所需的酶量為一個酶活力單位。

PLD活性(nmol/min /g 鮮重)=  ×C標(biāo)準(zhǔn)÷W÷T = 16.7×÷W

3.按照細(xì)胞數(shù)量計算

酶活性定義:104個細(xì)胞每分鐘水解磷脂酰膽堿產(chǎn)生1nmol膽堿所需的酶量為一個酶活力單位。

PLD活性(nmol/min /104 cell= ×C標(biāo)準(zhǔn)÷細(xì)胞數(shù)量÷T = 16.7×÷細(xì)胞數(shù)量

4.按照液體體積計算

酶活性定義:每毫升血清每分鐘水解磷脂酰膽堿產(chǎn)生1nmol膽堿所需的酶量為一個酶活力單位。

PLD活性(nmol/min /mL= ×C標(biāo)準(zhǔn)÷T=16.7×

C標(biāo)準(zhǔn):標(biāo)準(zhǔn)品濃度,500nmol/mLCpr:樣本蛋白濃度,mg/mLW:樣本質(zhì)量,g/mL;T:反應(yīng)時間,30min

 

注意事項:

1.        顯色完成后,若有沉淀,于8000rpm25℃離心5min后取上清測定。

2.        吸光值不宜超過1,否則用試劑一將酶液進(jìn)行稀釋,并在計算公式中乘以稀釋倍數(shù)。


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