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磷脂酶C( Phospholipases C,PLC )試劑盒說明書

發(fā)布時間:2023/5/12      點擊次數(shù):392

磷脂酶C Phospholipases CPLC )試劑盒說明書

 微量法100T/96S

 

    意:正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。

測定意義:

磷脂酶CEC3.1.4.3)是一種水解甘油磷酸酯C3位點甘油磷酸酯鍵的脂類水解酶,廣泛存在于微生物及動植物的組織和細胞中,在細胞代謝、細胞傳遞、生長發(fā)育等方面具有重要作用。

 

測定原理:

磷脂酶C催化水解NPPC產(chǎn)生對硝基苯酚,在410nm處有特征吸收峰。

 

自備實驗用品及儀器:

天平、研缽、超速冷凍離心機、可見分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96孔板、恒溫水浴鍋。

 

試劑組成和配制:

提取液:液體100mL×1瓶,4℃保存。

試劑一:液體102mL×1瓶,4℃保存。

試劑二:液體10mL×1瓶,4℃避光保存。

試劑三:液體8mL×1瓶,4℃保存。

 

酶液提?。?/span>

1.        組織:按照質(zhì)量(g):提取液體積(mL)15~10的比例(建議稱取約0.1g,加入1mL提取液)加入提取液,冰浴勻漿后于4℃,10000g離心5min,取全部上清于4℃、100000g離心30min,棄上清,取沉淀溶于1mL試劑一。

2.        細胞:按照細胞數(shù)量(104個):提取液體積(mL)為500~10001的比例(建議500萬細胞加入1mL提取液),冰浴超聲波破碎細胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時間3min);然后4℃,10000g離心5min,取全部上清于4℃、100000g離心30min,棄上清,取沉淀溶于1mL試劑一。

3.        血清:直接測定。                  

 

測定操作:

 


空白管

測定管

樣品(μL


20

試劑一(μL

20


試劑二(μL

100

100

充分混勻,37℃反應30min

試劑三(μL

80

80

充分混勻,于微量石英比色皿/96孔板,蒸餾水調(diào)零,測定410nm處吸光值,分別記為A空白管和A測定管,△A=A測定管-A空白管。

 

 

酶活計算公式

a. 用微量石英比色皿測定的計算公式如下

標準曲線:y = 0.0191x - 0.0103R2 = 0.9991

1.按照蛋白濃度計算

酶活性定義:每毫克蛋白每分鐘水解NPPC產(chǎn)生1nmol對硝基苯酚所需的酶量為一個酶活力單位。

PLC活性(nmol/min/mg prot=A+0.0103÷ 0.0191×V反總÷(V×Cpr) ÷T = 17.45×A+0.0103÷ Cpr

2.按照樣本質(zhì)量計算

酶活性定義:每克組織每分鐘水解NPPC產(chǎn)生1nmol對硝基苯酚所需的酶量為一個酶活力單位。

PLC活性(nmol/min/g 鮮重)=A+0.0103÷ 0.0191×V反總÷(V÷V樣總×W) ÷T

                          = 17.45×A+0.0103÷ W

3.按照細胞數(shù)量計算

酶活性定義:104個細胞每分鐘水解NPPC產(chǎn)生1nmol對硝基苯酚所需的酶量為一個酶活力單位。

PLC活性(nmol/min/104 cell=A+0.0103÷ 0.0191×V反總÷(V÷V樣總×細胞數(shù)量) ÷T

                          = 17.45×A+0.0103÷ 細胞數(shù)量

4.按照液體體積計算

酶活性定義:每毫升血清每分鐘水解NPPC產(chǎn)生1nmol對硝基苯酚所需的酶量為一個酶活力單位。

PLC活性(nmol/min/mL= A+0.0103÷ 0.0191×V反總÷V÷T

                       = 17.45×A+0.0103

V反總:反應總體積,0.2mL;V樣:加入樣本體積,0.02mL;V樣總:加入提取液體積,1mL;Cpr:樣本蛋白濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g;T:反應時間,30min

 

 

b.       96孔板測定的計算公式如下

標準曲線:y = 0.0095x - 0.0103,R2 = 0.9991

1.按照蛋白濃度計算

酶活性定義:每毫克蛋白每分鐘水解NPPC產(chǎn)生1nmol對硝基苯酚所需的酶量為一個酶活力單位。

PLC活性(nmol/min/mg prot=A+0.0103÷ 0.0095×V反總÷(V×Cpr) ÷T

                           = 35.09×A+0.0103÷ Cpr

2.按照樣本質(zhì)量計算

酶活性定義:每克組織每分鐘水解NPPC產(chǎn)生1nmol對硝基苯酚所需的酶量為一個酶活力單位。

PLC活性(nmol/min/g 鮮重)=A+0.0103÷ 0.0095×V反總÷(V÷V樣總×W) ÷T

                          = 35.09×A+0.0103÷ W

3.按照細胞數(shù)量計算

酶活性定義:104個細胞每分鐘水解NPPC產(chǎn)生1nmol對硝基苯酚所需的酶量為一個酶活力單位。

PLC活性(nmol/min/104 cell=A+0.0103÷ 0.0095×V反總÷(V÷V樣總×細胞數(shù)量) ÷T

                    =35.09×A+0.0103÷ 細胞數(shù)量

4.按照液體體積計算

酶活性定義:每毫升血清每分鐘水解NPPC產(chǎn)生1nmol對硝基苯酚所需的酶量為一個酶活力單位。

PLC活性(nmol/min/mL= A+0.0103÷ 0.0095×V反總÷V÷T

                    = 35.09×A+0.0103

V反總:反應總體積,0.2mL;V樣:加入樣本體積,0.02mL;V樣總:加入提取液體積,1mL;Cpr:樣本蛋白濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g;T:反應時間,30min


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