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磷脂酶A2(phospholipase A2,PLA2)試劑盒說明書

發(fā)布時間:2023/5/12      點擊次數(shù):303

磷脂酶A2phospholipase A2,PLA2)試劑盒說明書

微量法100T/48S

  正式測定之前選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。

測定意義:

磷脂酶A2EC3.1.1.4)是磷脂sn-2位脂酰基水解酶,廣泛存在于動植物組織、細(xì)菌、細(xì)胞核分泌物中,參與脂肪消化,精子成熟、細(xì)胞信號傳遞、脂質(zhì)過氧化修復(fù)、宿主反應(yīng)等生理過程,在控制體內(nèi)磷脂類物質(zhì)平衡、調(diào)節(jié)機體新陳代謝、參與疾病的病理進(jìn)程等方面發(fā)揮著及其重要的作用。

測定原理:

磷脂酶A2作用于2-硫代十六酰乙基磷酸膽堿(HEPC)產(chǎn)生游離巰基,與DTNB反應(yīng)生成黃色物質(zhì),在412nm處有特征吸收峰。

自備實驗用品及儀器:

天平、超速冷凍離心機、研缽、紫外分光光度計/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板

試劑組成和配制:

提取液:液體100mL×1瓶,4℃保存。

試劑一:液體100mL×1瓶,4℃保存。

試劑二:液體20mL×1瓶,4℃保存。

試劑三:液體×5瓶,-20℃避光保存。臨用前根據(jù)用量每瓶加入1.8mL試劑二充分混勻;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復(fù)凍融。

樣品處理:

1.        組織:按照質(zhì)量(g):提取液體積(mL)15~10的比例(建議稱取約0.1g,加入1mL提取液)加入提取液,冰浴勻漿后于4℃,10000g離心5min,取全部上清于4℃、100000g離心30min,棄上清,取沉淀溶于1mL試劑一。

2.        細(xì)胞:按照細(xì)胞數(shù)量(104個):提取液體積(mL)為500~10001的比例(建議500萬細(xì)胞加入1mL提取液),冰浴超聲波破碎細(xì)胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時間3min);然后4℃,10000g離心5min,取全部上清于4℃、100000g離心30min,棄上清,取沉淀溶于1mL試劑一。

3.        血清:直接測定。

測定操作:


對照管

測定管

樣品(μL

20

20

試劑二(μL

180


試劑三(μL


180

充分混勻,37℃反應(yīng)10min,于微量石英比色皿/96孔板,蒸餾水調(diào)零,測定412nm處吸光值,記為A對照管和A測定管,△A=A測定管- A對照管

計算公式:

a. 用微量石英比色皿測定的計算公式如下

1.按照蛋白濃度計算

酶活性定義:每毫克蛋白每分鐘水解HEPC產(chǎn)生1nmol游離巰基所需的酶量為一個酶活力單位。

PLA2活性(nmol/min/mg prot= ×d×V反總÷V×Cpr÷T= 73.53×A÷Cpr

2.按照樣本質(zhì)量計算

酶活性定義:每克組織每分鐘水解HEPC產(chǎn)生1nmol游離巰基所需的酶量為一個酶活力單位。

PLA2活性(nmol/min/g 鮮重)= ×d×V反總÷W×V÷V樣總)÷T= 73.53×A÷W

3. 細(xì)胞數(shù)量計算

酶活性定義:104個細(xì)胞每分鐘水解HEPC產(chǎn)生1nmol游離巰基所需的酶量為一個酶活力單位。

PLA2活性(nmol/min/104 cell= ×d×V反總÷V×細(xì)胞數(shù)量÷V樣總)÷T= 73.53×細(xì)胞數(shù)量

4按照液體體積計算

酶活性定義:每毫升血清每分鐘水解HEPC產(chǎn)生1nmol游離巰基所需的酶量為一個酶活力單位。

PLA2活性(nmol/min/mL= ×d×V反總÷V÷T= 73.53×A

TNB消光系數(shù),13600L/mol/cm;d:比色皿光徑,1cm;V反總:反應(yīng)總體積,1mLV樣:反應(yīng)體系中加入樣本體積,0.1mL;W:樣本質(zhì)量,gV樣總:加入提取液體積,1mL

T:反應(yīng)時間,10min

b. 96孔板測定的計算公式如下

1.按照蛋白濃度計算

酶活性定義:每毫克蛋白每分鐘水解HEPC產(chǎn)生1nmol游離巰基所需的酶量為一個酶活力單位。

PLA2活性(nmol/min/mg prot= ×d×V反總÷V×Cpr÷T=147.06×A÷Cpr

2.按照樣本質(zhì)量計算

酶活性定義:每克組織每分鐘水解HEPC產(chǎn)生1nmol游離巰基所需的酶量為一個酶活力單位。

PLA2活性(nmol/min/g 鮮重)= ×d×V反總÷W×V÷V樣總)÷T= 147.06×A÷W

3. 細(xì)胞數(shù)量計算

酶活性定義:104個細(xì)胞每分鐘水解HEPC產(chǎn)生1nmol游離巰基所需的酶量為一個酶活力單位。

PLA2活性(nmol/min/104 cell= ×d×V反總÷V×細(xì)胞數(shù)量÷V樣總)÷T=147.06×細(xì)胞數(shù)量

4按照液體體積計算

酶活性定義:每毫升血清每分鐘水解HEPC產(chǎn)生1nmol游離巰基所需的酶量為一個酶活力單位。

PLA2活性(nmol/min/mL= ×d×V反總÷V÷T= 147.06×A

TNB消光系數(shù),13600L/mol/cm;d:比色皿光徑,0.5cm;V反總:反應(yīng)總體積,1mL;V樣:反應(yīng)體系中加入樣本體積,0.1mL;W:樣本質(zhì)量,g;V樣總:加入提取液體積,1mL;

T:反應(yīng)時間,10min



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