脲酶(Urease, UE)測定試劑盒說明書
微量法100管/48樣
注 意:正式測定前務(wù)必取2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定
測定意義:
UE能夠水解尿素,產(chǎn)生氨和碳酸。UE活性與有機物質(zhì)含量、全氮和速效氮含量呈正相關(guān),反應(yīng)了氮素狀況。
測定原理:
利用靛酚藍比色法測定脲酶水解尿素產(chǎn)生的NH3-N。
需自備的儀器和用品:
可見分光光度計/酶標(biāo)儀、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰、甲苯(不允許快遞)和蒸餾水。
試劑的組成和配制:
提取液:液體60mL×1瓶,4℃保存;
試劑一:粉劑×1瓶,臨用前加入9mL蒸餾水,充分溶解待用,4℃保存;用不完的試劑4℃保存;
試劑二:液體22mL×1瓶,4℃保存;
試劑三A液:液體×1支,4℃保存;試劑三B液:液體×1瓶,4℃保存;臨用前將A液倒入B液中混合,待用;用不完的試劑4℃保存一周;
試劑四:液體2mL×1瓶,4℃保存;
樣本的前處理:
1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備:
細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞:先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量(104個):提取液體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液),超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞(冰浴,功率20%或200W,超聲3s,間隔10s,重復(fù)30次);8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。
組織:按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液),進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。
2、血清(漿)樣品:直接檢測。
測定步驟:
1、 分光光度計或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長至578nm,蒸餾水調(diào)零。
2、酶促反應(yīng)
試劑名稱 | 測定管 | 對照管 |
樣本(μL) | 20 | 20 |
試劑一(μL) | 90 | |
蒸餾水(μL) | 90 | |
試劑二(μL) | 190 | 190 |
混勻,放入37℃水浴1h后,10000g 25℃離心10min,取上清液。
2、將上清液稀釋10倍(取0.1mL上清液,加入0.9mL蒸餾水)。
3、測氨量(在微量石英比色皿或96孔板中加入下列試劑)
測定管 | 對照管 | |
稀釋后的上清液(μL) | 80 | 80 |
試劑三(μL) | 15 | 15 |
試劑四(μL) | 15 | 15 |
充分混勻,室溫放置20min
蒸餾水(μL) | 90 | 90 |
混勻,于578nm處,蒸餾水調(diào)零,讀吸光值A,計算ΔA=A測定管-A對照管。每個測定管設(shè)一個對照管。
UE活力計算
a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下
標(biāo)準(zhǔn)條件下測定的回歸方程為y = 0.0915x +0.0373;x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度(μg/mL),y為吸光值A。
1、血清(漿)UE活力的計算:
單位的定義:每mL血清(漿)每分鐘產(chǎn)生1μg NH3-N定義為一個酶活力單位。
UE活力(μg/min/mL)=(ΔA-0.0373) ÷0.0915×10×V反總÷V樣÷T=27.32×(ΔA -0.0373)
單位的定義:每天每g土樣中產(chǎn)生1μg NH3-N定義為一個酶活力單位。
2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中1μg NH3-N活力的計算:
(1)按樣本蛋白濃度計算:
單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘產(chǎn)生1μg NH3-N定義為一個酶活力單位。
UE活力(μg/min/mg prot)=(ΔA-0.0373) ÷0.0915×10×V反總÷(V樣×Cpr)÷T =27.32×(ΔA -0.0373) ÷Cpr
(2)按樣本鮮重計算:
單位的定義:每g組織每分鐘產(chǎn)生1μg NH3-N定義為一個酶活力單位。
UE活力(μg/min/ g 鮮重)=(ΔA-0.0373) ÷0.0915×10×V反總÷(W× V樣÷V樣總)÷T =27.32×(ΔA -0.0373) ÷W
(3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算:
單位的定義:每1萬個細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘產(chǎn)生1μg NH3-N定義為一個酶活力單位。
UE活力(μg/min/104 cell)=(ΔA-0.0373) ÷0.0915×10×V反總÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=0.0546×ΔA
10:稀釋倍數(shù);T:反應(yīng)時間,60min; V反總:反應(yīng)體系總體積:0.3mL;V樣:加入反應(yīng)體系中樣本體積,0.02mL;V樣總:提取液體積,1mL;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL; W:樣本質(zhì)量, g;500:細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),500萬。
b.用96孔板測定的計算公式如下
標(biāo)準(zhǔn)條件下測定的回歸方程為y = 0.04575x +0.0373;x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度(μg/mL),y為吸光值A。
1、血清(漿)UE活力的計算:
單位的定義:每mL血清(漿)每分鐘產(chǎn)生1μg NH3-N定義為一個酶活力單位。
UE活力(μg/min/mL)=(ΔA-0.0373) ÷0.04575×10×V反總÷V樣÷T=54.64×(ΔA -0.0373)
單位的定義:每天每g土樣中產(chǎn)生1μg NH3-N定義為一個酶活力單位。
2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中1μg NH3-N活力的計算:
(1)按樣本蛋白濃度計算:
單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘產(chǎn)生1μg NH3-N定義為一個酶活力單位。
UE活力(μg/min/mg prot)=(ΔA-0.0373) ÷0.04575×10×V反總÷(V樣×Cpr)÷T =54.64×(ΔA -0.0373) ÷Cpr
(2)按樣本鮮重計算:
單位的定義:每g組織每分鐘產(chǎn)生1μg NH3-N定義為一個酶活力單位。
UE活力(μg/min/g 鮮重)=(ΔA-0.0373) ÷0.04575×10×V反總÷(W× V樣÷V樣總)÷T =54.64×(ΔA -0.0373) ÷W
(3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算:
單位的定義:每1萬個細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘產(chǎn)生1μg NH3-N定義為一個酶活力單位。
UE活力(μg/min/104 cell)=(ΔA-0.0373) ÷0.04575×10×V反總÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=0.1092×ΔA
10:稀釋倍數(shù);T:反應(yīng)時間,60min; V反總:反應(yīng)體系總體積:0.3mL;V樣:加入反應(yīng)體系中樣本體積,0.02mL;V樣總:提取液體積,1mL;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL; W:樣本質(zhì)量, g;500:細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),500萬。
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