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酸性蛋白酶(Acid protease, ACP)試劑盒說(shuō)明書

發(fā)布時(shí)間:2023/4/4      點(diǎn)擊次數(shù):302

酸性蛋白酶(Acid protease, ACP)試劑盒說(shuō)明書

                                              微量法100T/48S

 

    意:正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

測(cè)定意義:

ACP是一種在酸性環(huán)境下催化蛋白質(zhì)水解的酶。該酶主要用于酒精發(fā)酵、啤酒釀造、毛皮軟化、果酒澄清、醬油釀造、飼料等。

 

測(cè)定原理:

酸性條件下,ACP催化酪蛋白水解產(chǎn)生酪氨酸;在堿性條件下,酪氨酸還原磷鉬酸化合物生成鎢藍(lán);鎢藍(lán)在680nm有特征吸收峰,通過(guò)測(cè)定其吸光度增加,來(lái)計(jì)算ACP活性。

 

自備儀器和樣品:

水浴鍋、磁力攪拌器、可調(diào)式移液槍、可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量玻璃比色皿/96孔板、0.5 mL EP管和蒸餾水。

 

試劑組成和配置:

液體一:2mL×1支,4℃保存。

液體二:1mL×1支,4℃保存。

試劑一的配制:臨用前按液體一:液體二:蒸餾水=90μL):20μL):21mL)的比例配制,現(xiàn)配現(xiàn)用,如出現(xiàn)白色絮狀沉淀則不能用。

試劑二:粉劑×1瓶,4℃保存。臨用前加4mL蒸餾水溶解。

試劑三:粉劑×1瓶,4℃避光保存。臨用前加入10mL試劑一,沸水浴中磁力攪拌溶解。(可在燒杯上蓋一層保鮮膜,注意觀察,避免水分全部蒸發(fā),一般加熱15-30分鐘,該試劑為過(guò)飽和試劑,充分混勻后仍出現(xiàn)顆粒物不溶物不影響使用)。

試劑四:粉劑×1瓶,4℃保存。臨用前加入20mL蒸餾水溶解。

試劑五:液體4mL×1瓶,4℃保存。

標(biāo)準(zhǔn)品:液體1mL×1支,0.25μmol/mL標(biāo)準(zhǔn)酪氨酸溶液,4℃保存。

 

粗酶液提取:

1、   試劑一的配制:見(jiàn)試劑的組成和配制。

2、組織:按照組織質(zhì)量(g:試劑一體(mL)15~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL試劑一)冰浴勻漿,8000g4離心10min,取上清,即粗酶液。

3、   血清或培養(yǎng)液:直接測(cè)定。

4、   細(xì)菌、真菌:按照細(xì)胞數(shù)量(104個(gè)):試劑一體積(mL)為500~10001的比例(建議500萬(wàn)細(xì)胞加入1mL試劑一),冰浴超聲波破碎細(xì)胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時(shí)間3min);然后8000g,4,離心10min,取上清置于冰上待測(cè)。

 

測(cè)定操作:

1.分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到680 nm,蒸餾水調(diào)零。

 

2.試劑二、試劑三和試劑四置于30℃水浴保溫30min。

3. 對(duì)照管:取0.5 mL EP管,加入20μL粗酶液,40μL試劑二,混勻后置于30℃水浴保溫10min;加入40μL試劑三,混勻后8000g,4℃離心10min;取40μL上清液,加入新的EP管,再加入200μL試劑四,40μL試劑五,混勻后置于30℃水浴保溫20min,取200μL于微量玻璃比色皿/96孔板,680nm測(cè)定光吸收,記為A對(duì)照管。

4. 測(cè)定管:取0.5 mL EP管,加入20μL粗酶液,40μL試劑三,混勻后置于30℃水浴保溫10min;加入40μL試劑二,混勻后8000g,4℃離心10min;取40μL上清液,加入新的EP管,再加入200μL試劑四,40μL試劑五,混勻后置于30℃水浴保溫20min,取200μL于微量玻璃比色皿/96孔板,于680nm測(cè)定光吸收,記為A測(cè)定管。(注意與空白管不同,先加試劑三,后加試劑二)

5. 空白管:取0.5 mL EP管,加入40μL蒸餾水,200μL試劑四,40μL試劑五,混勻后置于30℃水浴保溫20min,取200μL于微量玻璃比色皿/96孔板,于680nm測(cè)定光吸收,記為A空白管。

6. 標(biāo)準(zhǔn)管:取0.5 mL EP管,加入40μL標(biāo)準(zhǔn)品,200μL試劑四,40μL試劑五,混勻后置于30℃水浴保溫20min,取200μL于微量玻璃比色皿/96孔板,于680nm測(cè)定光吸收,記為A標(biāo)準(zhǔn)管。

 

ACP活性計(jì)算公式:

1. 按照樣本蛋白濃度計(jì)算

ACP活性單位定義:30每毫克蛋白每分鐘水解產(chǎn)生1nmol酪氨酸1個(gè)酶活單位。

ACP活性(nmol/min /mg prot= C標(biāo)準(zhǔn)品×A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)×V反總÷(Cpr×V1)÷T= 125×A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)÷Cpr

 

2.按照樣本質(zhì)量計(jì)算

ACP活性單位定義:30每克樣品每分鐘催化水解產(chǎn)生1 nmol酪氨酸為1個(gè)酶活單位。

ACP活性(nmol/min /g鮮重)=C標(biāo)準(zhǔn)品×A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)×V反總÷W×V1÷V2÷T= 125×A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)÷W

 

3. 按照液體體積計(jì)算

ACP活性單位定義:30每毫升樣品每分鐘催化水解產(chǎn)生1nmol酪氨酸為1個(gè)酶活單位。

ACP活性(nmol/min/mL=C標(biāo)準(zhǔn)品×A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)×V反總÷V1÷T= 125×A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)

1.        按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

ACP活性單位定義:30104個(gè)細(xì)胞每分鐘催化水解產(chǎn)生1nmol酪氨酸為1個(gè)酶活單位。

ACP活性(nmol/min /104 cell=C標(biāo)準(zhǔn)品×A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)×V反總÷(細(xì)胞數(shù)量×V1÷V2÷T= 125×A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)÷細(xì)胞數(shù)量

C標(biāo)準(zhǔn)品:0.25 μ mol/mL標(biāo)準(zhǔn)酪氨酸溶液;V反總:酶促反應(yīng)總體積,0.1mL;Cpr:粗酶液蛋白質(zhì)濃度(mg/mL);V1:加入反應(yīng)體系中粗酶液體積(mL),0.02 mL;V2:提取液總體積(mL),1mLT:催化反應(yīng)時(shí)間(min),10minW:樣品質(zhì)量(g)。

 

注意事項(xiàng):

1.試劑一按操作指示配制,用多少配多少,出現(xiàn)白色絮狀沉淀則不能用。

2.臨用前配制的試劑配置好后3天內(nèi)使用完畢。


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