胃蛋白酶(Pepsin)試劑盒說明書
微量法100T/48S
注 意:正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。
測(cè)定意義:
胃蛋白酶由胃粘膜主細(xì)胞分泌,分解食物中蛋白質(zhì)成小肽段。一般用于神經(jīng)性低酸癥的鑒別,慢性胃炎、慢性胃擴(kuò)張、慢性十二指腸炎等癥狀時(shí)也會(huì)引起胃蛋白酶分泌的減少。
測(cè)定原理:
胃蛋白酶可催化血紅蛋白水解,水解產(chǎn)物與福林試劑反應(yīng)后顯藍(lán)色;一定范圍內(nèi),其顏色的深淺與胃蛋白酶活性呈正比。
自備儀器和用品:
可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量玻璃比色皿/96孔板、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、研缽、冰和蒸餾水。
試劑組成和配制:
試劑一:液體100mL×1瓶,4℃保存。
試劑二:液體20mL×1瓶,4℃保存。
試劑三:粉劑×1瓶,4℃避光保存。臨用前加入10mL試劑二充分溶解。
試劑四:粉劑×1瓶,4℃保存。臨用前加入10mL蒸餾水充分溶解。
試劑五:粉劑×1瓶,4℃保存。臨用前加入15mL蒸餾水充分溶解。
試劑六:液體3.3mL×1瓶,4℃保存。
標(biāo)準(zhǔn)品:液體1.27mL×1支,0.5μmol/mL酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度4℃保存。
粗酶液提取:
組織樣品:按照組織質(zhì)量(g):試劑一體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL試劑一)冰浴勻漿,8000g,4℃離心10min,取上清,即粗酶液。
測(cè)定步驟:
1.分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到580 nm,蒸餾水調(diào)零。
2. 試劑三和試劑四置于37℃水浴預(yù)熱30min。
3. 標(biāo)準(zhǔn)管:取微量玻璃比色皿/96孔板,加入20μL標(biāo)準(zhǔn)品,40μL試劑二,120μL試劑五,20μL試劑六,混勻后室溫靜置20min,于580 nm測(cè)光吸收,記為A標(biāo)準(zhǔn)管。
4. 空白管:取微量玻璃比色皿/96孔板,加入20μL蒸餾水,40μL試劑二,120μL試劑五,20μL試劑六,混勻后室溫靜置20min,于 580 nm測(cè)光吸收,記為A標(biāo)準(zhǔn)空白管。
5. 對(duì)照管:取 EP管,加入100 μL蒸餾水,置于37℃水浴保溫10min;加入100μL試劑四,蓋緊后搖勻1min;加入20μL粗酶液,混勻后8000g 4℃離心10分鐘取上清;在微量玻璃比色皿/96孔板加入上清液20μL,再加入40μL試劑二,120μL試劑五,20μL試劑六,混勻后室溫靜置20min,于580 nm測(cè)光吸收,記為A空白管。
6. 測(cè)定管:取 EP管,加入20μL粗酶液,100μL試劑三,置于37℃水浴保溫10min;加入100μL試劑四,
蓋緊后搖勻1min;8000g 4℃離心10分鐘取上清;在微量玻璃比色皿/96孔板加入上清液20μL,再加入40μL試劑二,120μL試劑五,20μL試劑六,混勻后室溫靜置20min,于 580 nm測(cè)光吸收,記為A測(cè)定管。
注意:空白管和標(biāo)準(zhǔn)管只需要測(cè)定一次。
計(jì)算公式:
a.使用微量玻璃比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下
(1)按蛋白濃度計(jì)算
活性單位定義:37℃每毫克蛋白每分鐘催化血紅蛋白水解生成1nmol酪氨酸為1個(gè)酶活單位。
胃蛋白酶活性(nmol/min/mg prot)= C標(biāo)準(zhǔn)品×(A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)×稀釋倍數(shù)÷(Cpr×V1)÷T
=27500×(A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)÷Cpr
(2)按樣本質(zhì)量計(jì)算
活性單位定義:37℃每克組織每分鐘催化血紅蛋白水解生成1nmol酪氨酸為1個(gè)酶活單位。
胃蛋白酶活性(nmol/min/g 鮮重)= C標(biāo)準(zhǔn)品×(A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)×稀釋倍數(shù)÷(W×V1÷V2)÷T
=27500×(A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)÷W
C標(biāo)準(zhǔn)品:標(biāo)準(zhǔn)品濃度,0.5 μmol/mL酪氨酸;稀釋倍數(shù):(20+100+100)÷20=11;Cpr:粗酶液蛋白質(zhì)濃度(mg/mL),需要另外測(cè)定;V1:加入反應(yīng)體系中粗酶液體積(mL),20μL=2×10-2mL;W:組織質(zhì)量(g);V2:粗酶液總體積(mL),1mL;T:催化反應(yīng)時(shí)間(min),10min。
b.使用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下
((1)按蛋白濃度計(jì)算
活性單位定義:37℃每毫克蛋白每分鐘催化血紅蛋白水解生成1nmol酪氨酸為1個(gè)酶活單位。
胃蛋白酶活性(nmol/min/mg prot)= C標(biāo)準(zhǔn)品×(A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)×稀釋倍數(shù)÷(Cpr×V1)÷T
=27500×(A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)÷Cpr
(2)按樣本質(zhì)量計(jì)算
活性單位定義:37℃每克組織每分鐘催化血紅蛋白水解生成1nmol酪氨酸為1個(gè)酶活單位。
胃蛋白酶活性(nmol/min/g 鮮重)= C標(biāo)準(zhǔn)品×(A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)×稀釋倍數(shù)÷(W×V1÷V2)÷T
=27500×(A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)÷W
C標(biāo)準(zhǔn)品:標(biāo)準(zhǔn)品濃度,0.5 μmol/mL酪氨酸;稀釋倍數(shù):(20+100+100)÷20=11;Cpr:粗酶液蛋白質(zhì)濃度(mg/mL),需要另外測(cè)定;V1:加入反應(yīng)體系中粗酶液體積(mL),20μL=2×10-2mL;W:組織質(zhì)量(g);V2:粗酶液總體積(mL),1mL;T:催化反應(yīng)時(shí)間(min),10min。
注意事項(xiàng)
試劑三、試劑四、試劑五臨用前配制,配制好用不完的試劑4℃可保存一周。
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