糜蛋白酶(Chymotrypsin)試劑盒說明書
微量法100T/96S
注 意 :正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。
測定意義:
糜蛋白酶,又稱胰凝乳蛋白酶,是胰腺分泌的一種蛋白水解酶,能迅速分解變性蛋白質。糜蛋白酶的功能與胰蛋白酶相似,但是具有分解能力強、毒性低和不良反應小等優(yōu)點。臨床上糜蛋白酶用于痰液稀化,對膿性和非膿性痰液均有效;也用于創(chuàng)傷或手術后傷口愈合,如白內障摘除。
測定原理:
糜蛋白酶催化ATEE水解,產(chǎn)物在237 nm有特征光吸收;通過測定237 nm 光吸收增加速率,來計算糜蛋白酶活性。
自備儀器和用品:
臺式離心機、水浴鍋、可調式移液器、研缽、紫外分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96孔板(UV板)、冰和蒸餾水。
試劑組成和配制:
試劑一:液體100mL×1瓶,4℃保存。
試劑二:粉劑×1瓶,4℃避光保存。臨用前加入20 mL蒸餾水充分溶解。
粗酶液提?。?/span>
組織樣品:按照組織質量(g):試劑一體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL試劑一)冰浴勻漿,8000g,4℃離心10min,取上清,即粗酶液。
測定步驟:
1. 分光光度計/酶標儀預熱30min,調節(jié)波長到237 nm,蒸餾水調零。
2. 試劑二置于37℃水浴中保溫30min。
3. 空白管:取微量石英比色皿/96孔板,加入20μL試劑一,200μL試劑二,混勻于237nm測定4min內吸光值變化,記為△A空白管。(從吸光值穩(wěn)定增加開始計時)
4. 測定管:取微量石英比色皿/96孔板,加入20μL粗酶液,200μL試劑二,混勻于237nm測定4min內吸光值變化,記為△A測定管。(從吸光值穩(wěn)定增加開始計時)
注意:空白管只需要測定一次。
糜蛋白酶活性計算公式:
a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下
(1)按蛋白濃度計算
活性單位定義:25℃每毫克蛋白每分鐘催化吸光值增加1為一個酶活單位。
糜蛋白酶(U/mg prot)= (△A測定管-△A空白管) ×V反總÷(Cpr×V1)÷T
=2.75×(△A測定管-△A空白管)÷Cpr
(2)按樣本質量計算
活性單位定義:25℃每克樣品每分鐘催化吸光值增加1為一個酶活單位。
糜蛋白酶(U/g 鮮重)=(△A測定管-△A空白管) ×V反總÷(W×V1÷V2)÷T
=2.75×(△A測定管-△A空白管)÷W
W:樣品質量(g);Cpr:粗酶液蛋白質濃度(mg/mL),需要另外測定;V1:加入反應體系中粗酶液體積(mL),20μL=2×10-2 mL;V2:粗酶液總體積(mL),1 mL;V反總:反應總體積,220μL=0.22mL; T:反應時間(min),4min。
b.使用96孔板測定的計算公式如下
(1)按蛋白濃度計算
活性單位定義:25℃每毫克蛋白每分鐘催化吸光值增加1為一個酶活單位。
糜蛋白酶(U/mg prot)= (△A測定管-△A空白管) ×V反總÷(Cpr×V1)÷T
=2.75×(△A測定管-△A空白管)÷Cpr
(2)按樣本質量計算
活性單位定義:25℃每克樣品每分鐘催化吸光值增加1為一個酶活單位。
糜蛋白酶(U/g 鮮重)=(△A測定管-△A空白管) ×V反總÷(W×V1÷V2)÷T
=2.75×(△A測定管-△A空白管)÷W
W:樣品質量(g);Cpr:粗酶液蛋白質濃度(mg/mL),需要另外測定;V1:加入反應體系中粗酶液體積(mL),20μL=2×10-2 mL;V2:粗酶液總體積(mL),1 mL;V反總:反應總體積,220μL=0.22mL; T:反應時間(min),4min。
注意事項:
臨用前配制的試劑配置好后3天內使用完畢。
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