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谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)活性測定試劑盒說明書

發(fā)布時間:2023/3/31      點擊次數(shù):276

谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)活性測定試劑盒說明書

微量法100/48

 

   意:正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定

測定意義

GOT 2.6.1.1廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細胞中,催化可逆轉(zhuǎn)氨基反應,是氨基酸代謝的重要酶。此外,GOT在心肌細胞中含量最高,臨床上一般常作為心肌梗塞和心肌炎的輔助檢查。肝臟損害時其血清濃度也可升高。

 

測定原理

GOT催化 α-同戊二酸和天門冬氨酸發(fā)生轉(zhuǎn)氨基反應,生成谷氨酸和草酰乙酸,草酰乙酸進一步自行脫羧生成丙酮酸;丙酮酸可與2,4-er硝基苯肼反應生成2,4-er硝基苯腙,在堿性條件下顯棕紅色;測定505nm吸光度的變化,即可計算GOT酶活力。

 

需自備的儀器和用品

可見分光光計/酶標儀、水浴鍋、臺式離心機、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。

 

試劑的組成和配制

提取液:液體60mL×1瓶,4保存。

試劑一:液體2.5 mL×1瓶, 4保存;

試劑二:液體2.5 mL×1瓶, 4保存;

試劑三:液體25 mL×1瓶,4保存;

 

樣品測定的準備

1、細菌、細胞或組織樣品的制備:

細菌或培養(yǎng)細胞:先收集細菌或細胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;按照細菌或細胞數(shù)量(104個):提取液體積(mL)為500~10001的比例(建議500萬細菌或細胞加入1mL提取液),超聲波破碎細菌或細胞(冰浴,功率20%或200W,超聲3s,間隔10s,重復30次);8000g 4離心10min,取上清,置冰上待測。

組織:按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)15~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液),進行冰浴勻漿。8000g 4離心10min,取上清,置冰上待測。

2、血清(漿)樣品:直接檢測。

 

測定操作表

1、   分光光度計或酶標儀預熱30min以上,調(diào)節(jié)波長至505nm,蒸餾水調(diào)零。

2、   EP管或在96孔板中加入下列試劑

試劑名稱(μL

測定管

對照管

待測樣本

10


煮沸10min的待測樣本


10

試劑一 

25


蒸餾水


25

混勻后,37℃(哺乳動物)或25℃(其它物種)準確反應20min

試劑二

25

25

混勻后,37℃(哺乳動物)或25℃(其它物種)準確反應20min

試劑三

240

240

混勻,室溫(25)放置10min505nm波長處測各管吸光度A。ΔA=A測定管-A對照管。每個測定管需設一個對照管。

 

計算

a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下

1、標準條件下測定的回歸曲線, y = 0.4768x-0.0013   (x為標準品濃度,umol/mL;y為ΔA)

2、血清(漿)GOT活力的計算

單位的定義:每mL血清(漿)每分鐘催化產(chǎn)生1nmol丙酮酸定義為一個酶活力單位。

GOTnmol/min/mL=ΔA+0.0013÷0.4768÷T×103=104.9×ΔA+0.0013

3、細胞、細菌和組織中GOT活力的計算

1)按樣本蛋白濃度計算:

單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1 nmol丙酮酸定義為一個酶活力單位。

GOTnmol/min/mg prot=[ΔA+0.0013÷0.4786×V1]÷(V1×Cpr)÷T×103 =104.9×ΔA+0.0013÷Cpr

需要另外測定,建議使用本公司BCA蛋白質(zhì)含量測定試劑盒。

2 按樣本鮮重計算:

單位的定義:每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1nmol丙酮酸定義為一個酶活力單位。

GOTnmol/min/g鮮重)=[ΔA+0.0013÷0.4768×V1]÷(W×V1÷V2)÷T×103 =104.9×ΔA+0.0013÷W

3)按細菌或細胞密度計算:

單位的定義:每1萬個細菌或細胞每分鐘催化產(chǎn)生1nmol丙酮酸定義為一個酶活力單位。

GOTnmol/min/104 cell=[ΔA+0.0013÷0.4768×V1]÷(500×V1÷V2)÷T×103 =0.21×ΔA+0.0013

V1:加入反應體系中樣本體積,0.01mL;V2:加入提取液體積,1 mL;T:反應時間,20min;Cpr:蛋白質(zhì)濃度,mg/mLW:樣本質(zhì)量,g500:細胞或細菌總數(shù),500萬;1031umol/mL=103 nmol/mL

 

b.使用96孔板測定的計算公式如下:

1、標準條件下測定的回歸曲線, y = 0.2384x-0.0013   (x為標準品濃度,umol/mL;y為ΔA)。

2、血清(漿)GOT活力的計算

單位的定義:每mL血清(漿)每分鐘催化產(chǎn)生1nmol丙酮酸定義為一個酶活力單位。

GOTnmol/min/mL=ΔA+0.0013÷0.2384÷T×103=209.7×ΔA+0.0013

3、細胞、細菌和組織中GOT活力的計算

1)按樣本蛋白濃度計算:

單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1 nmol丙酮酸定義為一個酶活力單位。

GOTnmol/min/mg prot=[ΔA+0.0013÷0.2384×V1]÷(V1×Cpr)÷T×103 =209.7×ΔA+0.0013÷Cpr

需要另外測定,建議使用本公司BCA蛋白質(zhì)含量測定試劑盒。

2 按樣本鮮重計算:

單位的定義:每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1nmol丙酮酸定義為一個酶活力單位。

GOTnmol/min/g鮮重)=[ΔA+0.0013÷0.2384×V1]÷(W×V1÷V2)÷T×103 =209.7×ΔA+0.0013÷W

3)按細菌或細胞密度計算:

 

單位的定義:每1萬個細菌或細胞每分鐘催化產(chǎn)生1nmol丙酮酸定義為一個酶活力單位。

GOTnmol/min/104 cell= [ΔA+0.0013÷0.2384×V1]÷(500×V1÷V2)÷T×103 =0.419×ΔA+0.0013

V1:加入反應體系中樣本體積,0.01mL;V2:加入提取液體積,1 mL;T:反應時間,20 min;Cpr:蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g;500:細胞或細菌總數(shù),500萬;1031umol/mL=103 nmol/mL。

1、   標準曲線線性范圍為:0.01 umol/mL -2 umol/mL

2、   ΔA線性范圍為:0.01 -1。


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