谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)活性測(cè)定試劑盒說明書
微量法100管/48樣
注 意:正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定
測(cè)定意義:
GPT(EC 2.6.1.2)廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中,催化氨基酸和酮酸轉(zhuǎn)氨基反應(yīng),在氨基酸代謝中具有重要作用。此外,哺乳動(dòng)物肝細(xì)胞GPT活性很高,當(dāng)肝細(xì)胞壞死,GPT釋放到血液中,血清GPT活性顯著增高。因此,GPT被世界衛(wèi)生組織推薦為肝功能損害最敏感的檢測(cè)指標(biāo)。
測(cè)定原理
GPT催化丙氨酸和α-酮戊二酸發(fā)生轉(zhuǎn)氨基反應(yīng),生成丙酮酸和谷氨酸;加入2,4-er硝基苯肼溶液,不僅終止上述反應(yīng),而且與酮酸中的羰基加成,生成丙酮酸苯腙;苯腙在堿性條件下呈紅棕色,可以在505nm讀取吸光值并計(jì)算酶活力。
試驗(yàn)中所需的儀器和用品:
可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。
試劑的組成和配制
提取液:60mL×1瓶,4℃保存。
試劑一:液體2.5 mL×1瓶, 4℃保存;
試劑二:液體2.5 mL×1瓶, 4℃保存;
試劑三:液體25 mL×1瓶,4℃保存;
樣品測(cè)定的準(zhǔn)備
1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備:
細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞:先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量(104個(gè)):提取液體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液),超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞(冰浴,功率20%或200W,超聲3s,間隔10s,重復(fù)30次);8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測(cè)。
組織:按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液),進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測(cè)。
2、血清(漿)樣品:直接檢測(cè)。
測(cè)定步驟
1、 分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至505nm,蒸餾水調(diào)零。
2、 在EP管或在96孔板中加入下列試劑
試劑名稱(μL) | 測(cè)定管 | 對(duì)照管 |
待測(cè)樣本 | 10 | |
煮沸10min的待測(cè)樣本 | 10 | |
試劑一 | 25 | |
蒸餾水 | 25 |
混勻后,37℃(哺乳動(dòng)物)或25℃(其它物種)準(zhǔn)確反應(yīng)20min
試劑二 | 25 | 25 |
混勻后,37℃(哺乳動(dòng)物)或25℃(其它物種)準(zhǔn)確反應(yīng)20min
試劑三 | 240 | 240 |
混勻,室溫(25℃)放置10min,在505nm波長(zhǎng)處測(cè)各管吸光度A。ΔA=A測(cè)定管-A對(duì)照管。每個(gè)測(cè)定管需設(shè)一個(gè)對(duì)照管。
計(jì)算
a.用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下
1、標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定的回歸曲線, y = 0.4228x+0.0003 (x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度,umol/mL;y為ΔA)。
2、血清(漿)GPT活力的計(jì)算
單位的定義:每mL血清(漿)每分鐘催化產(chǎn)生1nmol丙酮酸定義為一個(gè)酶活力單位。
GPT(nmol/min/mL)=(ΔA-0.0003)÷0.4228÷T×103=118.26×(ΔA-0.0003)
3、細(xì)胞、細(xì)菌和組織中GPT活力的計(jì)算
(1)按樣本蛋白濃度計(jì)算:
單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1 nmol丙酮酸定義為一個(gè)酶活力單位。
GPT(nmol/min/mg prot)=[(ΔA-0.0003)÷0.4228×V1]÷(V1×Cpr)÷T×103 =118.26×(ΔA-0.0003)÷Cpr
需要另外測(cè)定,建議使用本公司BCA蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒。
(2) 按樣本鮮重計(jì)算:
單位的定義:每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1nmol丙酮酸定義為一個(gè)酶活力單位。
GPT(nmol/min/g鮮重)=[(ΔA-0.0003)÷0.4228×V1]÷(W×V1÷V2)÷T×103 =118.26×(ΔA-0.0003)÷W
(3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算:
單位的定義:每1萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生1nmol丙酮酸定義為一個(gè)酶活力單位。
GPT(nmol/min/104 cell)=[(ΔA-0.0003)÷0.4228×V1]÷(500×V1÷V2)÷T×103 =0.236×(ΔA-0.0003)
V1:加入反應(yīng)體系中樣本體積,0.01mL;V2:加入提取液體積,1 mL;T:反應(yīng)時(shí)間,20min;Cpr:蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g;500:細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù),500萬;103:1umol/mL=103 nmol/mL。
b.使用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下:
1、標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定的回歸曲線, y = 0.2114x+0.0003 (x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度,umol/mL;y為ΔA)。
2、血清(漿)GPT活力的計(jì)算
單位的定義:每mL血清(漿)每分鐘催化產(chǎn)生1nmol丙酮酸定義為一個(gè)酶活力單位。
GPT(nmol/min/mL)=(ΔA-0.0003)÷0.2114÷T×103=236.5×(ΔA-0.0003)
3、細(xì)胞、細(xì)菌和組織中GPT活力的計(jì)算
(1)按樣本蛋白濃度計(jì)算:
單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1 nmol丙酮酸定義為一個(gè)酶活力單位。
GPT(nmol/min/mg prot)=[(ΔA-0.0003)÷0.2114×V1]÷(V1×Cpr)÷T×103 =236.5×(ΔA-0.0003)÷Cpr
需要另外測(cè)定,建議使用本公司BCA蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒。
(2) 按樣本鮮重計(jì)算:
單位的定義:每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1nmol丙酮酸定義為一個(gè)酶活力單位。
GPT(nmol/min/g鮮重)=[(ΔA-0.0003)÷0.2114×V1]÷(W×V1÷V2)÷T×103 =236.5×(ΔA-0.0003)÷W
(3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算:
單位的定義:每1萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生1nmol丙酮酸定義為一個(gè)酶活力單位。
GPT(nmol/min/104 cell)=[(ΔA-0.0003)÷0.2114×V1]÷(500×V1÷V2)÷T×103 =0.473×(ΔA-0.0003)
V1:加入反應(yīng)體系中樣本體積,0.01mL;V2:加入提取液體積,1 mL;T:反應(yīng)時(shí)間,20 min;Cpr:蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g;500:細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù),500萬;103:1umol/mL=103 nmol/mL。
1、 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍為:0.01 umol/mL -2 umol/mL。
2、 ΔA線性范圍為:0.01 -1。
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