賴氨酸(lysine,Lys)含量測(cè)定試劑盒說明書
微量法100管/96樣
注 意:正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定
測(cè)定意義:
賴氨酸是人體必需氨基酸之一,能促進(jìn)人體發(fā)育、增強(qiáng)免疫功能,并有提高中樞神經(jīng)組織功能的作用。賴氨酸為堿性必需氨基酸。由于谷物食品中的賴氨酸含量甚低,且在加工過程中易被破壞而缺乏,故稱為第一限制性氨基酸。
測(cè)定原理:
蛋白質(zhì)中的賴氨酸具有一個(gè)游離的ε-NH2,它與茚三酮試劑反應(yīng)生成藍(lán)紫色物質(zhì),其顏色的深淺在一定范圍內(nèi)與賴氨酸的含量成線性關(guān)系。亮氨酸與賴氨酸的碳原子數(shù)目相同,而且僅有—個(gè)游離氨基(ε-NH2),所以通常用亮氨酸配制標(biāo)準(zhǔn)液。
需自備的儀器和用品:
可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰、蒸餾水、水浴鍋。
試劑的組成和配制:
提取液:液體100mL×1瓶,4℃保存;
試劑一:粉劑×1瓶,4℃保存;臨用前加入12.5mL試劑三充分溶解混勻;
試劑二:液體12.5mL×1瓶,4℃保存;
試劑三:液體15mL×1瓶,4℃保存;
試劑四:60%乙醇,自備。
賴氨酸提取:
樣本烘干粉碎,稱取約0.01g樣本,加入1mL提取液,充分勻漿。80℃水浴提取20min,冷卻后10000g離心10min,取上清待測(cè)。
測(cè)定步驟:
1、 分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至570nm,蒸餾水調(diào)零。
2、 工作液的配制:取10mL試劑一與10mL試劑二混合搖勻,取上清備用。用不完的試劑4℃保存。
3、 在有蓋EP管中加入下列試劑:
試劑名稱(μL) | 測(cè)定管 | 空白管 |
樣本 | 100 | |
提取液 | 100 | |
工作液 | 200 | 200 |
混勻,80℃水浴30min(蓋緊,以防止水分散失),冷卻至常溫。
試劑四 | 300 | 300 |
混勻,取200μL至微量石英比色皿或96孔板中,于530nm波長(zhǎng)處記錄吸光值A。△A=A測(cè)定管-A空白管。
空白管只要做一管。
賴氨酸含量計(jì)算:
a.用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下
標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定回歸方程為y = 0.0062x - 0.0212;x為賴氨酸含量(µg/mL),y為吸光值。
1.按照蛋白濃度計(jì)算
賴氨酸含量(µg/mg prot)=[(△A +0.0212)÷0.0062×V1]÷(Cpr ×V1)×1.1515
=185.73×(△A+0.0212) ÷Cpr
2.按照樣本質(zhì)量計(jì)算
賴氨酸含量(µg/g干重)=[(△A +0.0212)÷0.0062×V1]÷(W ×V1÷V2)×1.1515
=185.73×(△A+0.0212) ÷W
V1:加入反應(yīng)體系中樣本體積,0.1mL;V2:加入提取液體積,1 mL;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g;1.1515,校正系數(shù)。
b.用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下
標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定回歸方程為y = 0.0031x - 0.0212;x為賴氨酸含量(µg/mL),y為吸光值。
1.按照蛋白濃度計(jì)算
賴氨酸含量(µg/mg prot)=[(△A +0.0212)÷0.0031×V1]÷(Cpr ×V1)×1.1515
=371.45×(△A+0.0212) ÷Cpr
2.按照樣本質(zhì)量計(jì)算
賴氨酸含量(µg/g干重)= [(△A +0.0212)÷0.0031×V1]÷(W ×V1÷V2)×1.1515
=371.45×(△A+0.0212) ÷W
V1:加入反應(yīng)體系中樣本體積,0.1mL;V2:加入提取液體積,1 mL;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g;1.1515,校正系數(shù)。
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