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牛細(xì)小病毒(BPV)核酸擴(kuò)增檢測試劑盒說明書

發(fā)布時間:2023/3/10      點(diǎn)擊次數(shù):863

【產(chǎn)品名稱】

通用名稱:牛細(xì)小病毒(BPV)核酸擴(kuò)增檢測試劑盒(熒光-PCR) 

Name  Bovine Parvovirus Detection Kit (Real-Time PCR Method)

 

【包裝規(guī)格】48T/

                                                                   

【預(yù)期用途】

牛細(xì)小病毒病是由牛細(xì)小病毒感染引起的一種接觸性傳染病。該病主要臨床特征是母牛生殖機(jī)能障礙和犢牛呼吸道、消化道疾病。該病毒主要經(jīng)口和空氣等途徑傳遞。

本試劑盒適用于檢測腹瀉糞便、腸系膜淋巴結(jié)、肝臟、腎、肺、肝、腦、睪丸、胎盤和淋巴結(jié)、全血等樣本中的牛細(xì)小病毒,用于牛細(xì)小病毒感染的輔助診斷。

 

【檢驗(yàn)原理】

本試劑盒根據(jù)牛細(xì)小病毒基因組設(shè)計(jì)特異性引物和探針[1-2],用熒光PCR技術(shù)對牛細(xì)小病毒的核酸進(jìn)行體外擴(kuò)增檢測,用于臨床上對可疑感染者的病原學(xué)診斷。

 

【試劑組成】

     

  規(guī)     

核酸提取液

          1.5mL×2

酶液

       50μL×1

BPV反應(yīng)液

      1.0mL×1

BPV陽性質(zhì)控品

      50μL×1

陰性質(zhì)控品

     250μL×1

說明:不同批號的試劑盒組分不可交互使用。

 

【儲存條件及有效期】

-20℃±5℃,避光保存、運(yùn)輸、反復(fù)凍融次數(shù)不超過5次,有效期12個月。

 

適用儀器

ABI 、安捷倫MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、eppendorf等系列熒光定量PCR檢測儀。

 

【標(biāo)本采集】

疑似感染仔牛取腸系膜淋巴結(jié)或肝臟;流產(chǎn)或死胎的腎、肺、肝、腦、睪丸和胎盤肺、淋巴結(jié)等組織;待檢活牛,用注射器取血5mL

 

【保存和運(yùn)輸】

上述標(biāo)本短期內(nèi)可保存于-20℃,長期保存可置-70℃,但不能超過6個月,標(biāo)本運(yùn)送應(yīng)采用2~8℃冰袋運(yùn)輸,嚴(yán)禁反復(fù)凍融。

 【使用方法】

1. 樣品處理(樣本處理區(qū))

1.1 樣本前處理

組織、糞便樣品:取樣品約1g,于研磨器中研磨,加入1.5mL生理鹽水后繼續(xù)研磨,待勻漿后轉(zhuǎn)至1.5mL滅菌離心管中,8000rpm離心2min,取上清液100μL于1.5mL滅菌離心管中;全血樣本:待血凝固后,取血清100μL于滅菌離心管中。1.2 DNA提取

1) 對上述處理好的標(biāo)本加入50μL核酸提取液,100℃恒溫處理10min,13,000 rpm離心5min,取上清液轉(zhuǎn)移至新的1.5mL EP管,-20℃保存

2) DNA的提取也可以采用優(yōu)利科(上海)生命科學(xué)有限公司生產(chǎn)的DNA提取試劑盒(離心柱提取法),請嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

2. 試劑配制(試劑準(zhǔn)備區(qū))

根據(jù)待檢測樣本總數(shù),設(shè)所需要的PCR反應(yīng)管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1管陰性對照+1管陽性對照;樣品每滿7份,多配制1份),每測試反應(yīng)體系配制如下表:

試劑

BPV反應(yīng)液

酶液

用量(樣本數(shù)為N

20μL

1μL

 

3.加樣(樣本處理區(qū))

將步驟1提取的DNA、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取4μL,分別加入相應(yīng)的反應(yīng)管中,蓋好管蓋,混勻,短暫離心。

4. PCR擴(kuò)增(核酸擴(kuò)增區(qū))

4.1 將待檢測反應(yīng)管置于熒光定量PCR儀反應(yīng)槽內(nèi);

4.2 設(shè)置好通道、樣品信息,反應(yīng)體系設(shè)置為25μL;

熒光通道選擇: 檢測通道(Reporter Dye)FAM, 淬滅通道(Quencher Dye)NONE,請勿選擇ROX參比熒光。

4.3 推薦循環(huán)參數(shù)設(shè)置:

步驟

循環(huán)數(shù)

溫度

時間

收集熒光信號

1

1 cycle

95℃

10min

2

40 cycles

94℃

15sec

55℃

30sec

 

結(jié)果分析判定

5.1 結(jié)果分析條件設(shè)定

設(shè)置Baseline和Threshold:一般直接按機(jī)器自動分析的結(jié)果分析,當(dāng)曲線出現(xiàn)整體傾斜時,根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié)Baseline的start值(一般可在3~15范圍內(nèi)調(diào)節(jié))、stop值(一般可在5~20范圍內(nèi)調(diào)節(jié)),以及Threshold的Value值(上下拖動閾值線至高于陰性對照),重新分析結(jié)果。

 

5.2 結(jié)果判斷

陽性:檢測通道Ct值≤35,且曲線有明顯的指數(shù)增長曲線;

可疑:檢測通道35<Ct值≤38,建議重復(fù)檢測,如果檢測通道仍為35<Ct值≤38,且曲線有明顯的增長曲線,判定為陽性,否則為陰性;

陰性:樣本檢測結(jié)果Ct值>38或無Ct值。

 

6. 質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)

陰性質(zhì)控品:Ct>38或無Ct值顯示;

陽性質(zhì)控品:擴(kuò)增曲線有明顯指數(shù)生長期,且Ct值≤32;

以上條件應(yīng)同時滿足,否則實(shí)驗(yàn)視為無效。

 

7. 檢測方法的局限性

? 樣本檢測結(jié)果與樣本收集、處理、運(yùn)送以及保存質(zhì)量有關(guān);

? 樣本提取過程中沒有控制好交叉污染,會出現(xiàn)假陽性結(jié)果;

? 陽性對照、擴(kuò)增產(chǎn)物泄漏,會導(dǎo)致假陽性結(jié)果;

? 病原體在流行過程中基因突變、重組,會導(dǎo)致假陰性結(jié)果;

? 不同的提取方法存在提取效率差異,會導(dǎo)致假陰性結(jié)果;

? 試劑運(yùn)輸,保存不當(dāng)或試劑配制不準(zhǔn)確引起的試劑檢測效能下降,出現(xiàn)假陰性或定量檢測不準(zhǔn)確的結(jié)果;

? 本檢測結(jié)果僅供參考,如須確診請結(jié)合臨床癥狀以及其他檢測手段。

 

 

注意事項(xiàng)

? 所有操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行;

? 試劑盒內(nèi)各種組分使用前應(yīng)自然融化,wan混勻并短暫離心;

? 反應(yīng)液應(yīng)避光保存;

? 反應(yīng)中盡量避免氣泡存在,管蓋需蓋緊;

? 使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)專用工作服;

? 樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進(jìn)行,以免交叉污染;

? 實(shí)驗(yàn)完畢后用10%次氯酸或75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器;

? 試劑盒里所有物品應(yīng)視為污染物對待,并按照《微生物生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室生物安全通則》進(jìn)行處理。

 

【參考文獻(xiàn)】

[1] 羅濟(jì)冠. 牛細(xì)小病毒檢測試劑的制備及快速檢測方法的建立[J]. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué), 2012.

[2] 鄭從義, 郭佳, 李勇. CN101565759A 一種檢測牛細(xì)小病毒的熒光定量PCR試劑盒及應(yīng)用. 中華人民共和國專li.


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