【產(chǎn)品名稱】
通用名稱:牛腺病毒3型(BAV-3)核酸檢測(cè)試劑盒(熒光-PCR法)
Name :Bovine Adenovirus Detection Kit(Real-Time PCR Method)
【包裝規(guī)格】48T/盒
【預(yù)期用途】
牛腺病毒3型(BAV-3)是引起牛呼吸道疾病的主要病原體之一,特別是新生犢牛。臨床癥狀包括發(fā)燒,呼吸困難,鼻腔和眼結(jié)膜有分泌物等。病理變化主要舉行阿玉肺部,具有鮮明的肺小葉wei縮、肺氣腫和突變。血清學(xué)調(diào)查表明該病廣泛分布于世界各地,給養(yǎng)牛業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。
本試劑盒適用于檢測(cè)肺組織、呼吸道及眼鼻分泌物等樣本中的牛腺病毒3型,用于牛腺病毒3型感染的輔助診斷。
【檢驗(yàn)原理】
本試劑盒采用TaqMan探針?lè)▽?shí)時(shí)熒光PCR技術(shù),根據(jù)牛腺病毒3型基因保守區(qū)設(shè)計(jì)特異性引物和探針,用熒光PCR技術(shù)對(duì)牛腺病毒3型的核酸進(jìn)行體外擴(kuò)增檢測(cè),用于臨床上對(duì)可疑感染者的病原學(xué)診斷。
【試劑組成】
名 稱 | 規(guī) 格 |
核酸提取液 | 1.5mL×2管 |
酶液 | 50μL×1管 |
BAV-3反應(yīng)液 | 1.0mL×1管 |
BAV-3陽(yáng)性質(zhì)控品 | 50μL×1管 |
陰性質(zhì)控品 | 250μL×1管 |
注:不同批號(hào)試劑不能混用。
【儲(chǔ)存條件及有效期】
-20℃±5℃,避光保存、運(yùn)輸、反復(fù)凍融次數(shù)不超過(guò)5次,有效期12個(gè)月。
【適用儀器】
ABI 、安捷倫MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf等系列熒光定量PCR檢測(cè)儀。
【標(biāo)本采集】
捕殺牛:取肺部病變組織,5g;活牛:用滅菌棉拭子沾取牛氣管或眼鼻分泌物,然后置于裝有0.5mL生理鹽水的離心管中。
【保存和運(yùn)輸】
上述標(biāo)本短期內(nèi)可保存于-20℃,長(zhǎng)期保存可置-70℃,但不能超過(guò)6個(gè)月,標(biāo)本運(yùn)送應(yīng)采用2~8℃冰袋運(yùn)輸,嚴(yán)禁反復(fù)凍融。
【使用方法】
1. 樣品處理(樣本處理區(qū))
1.1 樣本前處理
組織樣品:稱取樣品約1g,手術(shù)剪剪碎混勻后于研磨器中研磨,加入1.5mL生理鹽水后繼續(xù)研磨,待勻漿后轉(zhuǎn)至1.5mL滅菌離心管中,8000rpm離心2min,取上清液100μL于1.5mL滅菌離心管中;棉拭子:直接取100μL于1.5mL滅菌離心管中。
1.2 DNA提取
1) 對(duì)上述處理好的標(biāo)本加入50μL核酸提取液,100℃恒溫處理10min,13,000 rpm離心5min,取上清液轉(zhuǎn)移至新的1.5mL EP管,-20℃保存;
2) DNA的提取也可以采用優(yōu)利科(上海)生命科學(xué)有限公司生產(chǎn)的DNA提取試劑盒(離心柱提取法),請(qǐng)嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。
2. 試劑配制(試劑準(zhǔn)備區(qū))
根據(jù)待檢測(cè)樣本總數(shù),設(shè)所需要的PCR反應(yīng)管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1管陰性對(duì)照+1管陽(yáng)性對(duì)照;樣品每滿7份,多配制1份),每測(cè)試反應(yīng)體系配制如下表:
試劑 | BAV-3反應(yīng)液 | 酶液 |
用量(樣本數(shù)為N) | 20μL | 1μL |
將混合好的測(cè)試反應(yīng)液分裝到PCR反應(yīng)管中,21uL/管。
3. 加樣(樣本處理區(qū))
將步驟1提取的DNA、陽(yáng)性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取4μL,分別加入相應(yīng)的反應(yīng)管中,蓋好管蓋,混勻,短暫離心。
4. PCR擴(kuò)增(核酸擴(kuò)增區(qū))
4.1 將待檢測(cè)反應(yīng)管置于熒光定量PCR儀反應(yīng)槽內(nèi);
4.2 設(shè)置好通道、樣品信息,反應(yīng)體系設(shè)置為25μL;
熒光通道選擇: 檢測(cè)通道(Reporter Dye)FAM, 淬滅通道(Quencher Dye)NONE,請(qǐng)勿選擇ROX參比熒光。
4.3 推薦循環(huán)參數(shù)設(shè)置:
步驟 | 循環(huán)數(shù) | 溫度 | 時(shí)間 | 收集熒光信號(hào) |
1 | 1 cycle | 95℃ | 10min | 否 |
2 | 40 cycles | 94℃ | 15sec | 否 |
55℃ | 30sec | 是 |
5. 結(jié)果分析判定
5.1 結(jié)果分析條件設(shè)定
設(shè)置Baseline和Threshold:一般直接按機(jī)器自動(dòng)分析的結(jié)果分析,當(dāng)曲線出現(xiàn)整體傾斜時(shí),根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié)Baseline的start值(一般可在3~15范圍內(nèi)調(diào)節(jié))、stop值(一般可在5~20范圍內(nèi)調(diào)節(jié)),以及Threshold的Value值(上下拖動(dòng)閾值線至高于陰性對(duì)照),重新分析結(jié)果。
5.1 結(jié)果判斷
陽(yáng)性:檢測(cè)通道Ct值≤35,且曲線有明顯的指數(shù)增長(zhǎng)曲線;
可疑:檢測(cè)通道35<Ct值≤38,建議重復(fù)檢測(cè),如果檢測(cè)通道仍為35<Ct值≤38,且曲線有明顯的增長(zhǎng)曲線,判定為陽(yáng)性,否則為陰性;
陰性:樣本檢測(cè)結(jié)果Ct值>38或無(wú)Ct值。
6. 質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)
陰性質(zhì)控品:Ct>38或無(wú)Ct值顯示;
陽(yáng)性質(zhì)控品:擴(kuò)增曲線有明顯指數(shù)生長(zhǎng)期,且Ct值≤32;
以上條件應(yīng)同時(shí)滿足,否則實(shí)驗(yàn)視為無(wú)效。
7. 檢測(cè)方法的局限性
? 樣本檢測(cè)結(jié)果與樣本收集、處理、運(yùn)送以及保存質(zhì)量有關(guān);
? 樣本提取過(guò)程中沒(méi)有控制好交叉污染,會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果;
? 陽(yáng)性對(duì)照、擴(kuò)增產(chǎn)物泄漏,會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果;
? 病原體在流行過(guò)程中基因突變、重組,會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果;
? 不同的提取方法存在提取效率差異,會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果;
? 試劑運(yùn)輸,保存不當(dāng)或試劑配制不準(zhǔn)確引起的試劑檢測(cè)效能下降,出現(xiàn)假陰性或定量檢測(cè)不準(zhǔn)確的結(jié)果;
? 本檢測(cè)結(jié)果僅供參考,如須確診請(qǐng)結(jié)合臨床癥狀以及其他檢測(cè)手段。
【注意事項(xiàng)】
? 所有操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行;
? 試劑盒內(nèi)各種組分使用前應(yīng)自然融化,wan全混勻并短暫離心;
? 反應(yīng)液應(yīng)避光保存;
? 反應(yīng)中盡量避免氣泡存在,管蓋需蓋緊;
? 使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)專用工作服;
? 樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進(jìn)行,以免交叉污染;
? 實(shí)驗(yàn)完畢后用10%次氯酸或75%酒精或紫外燈處理工作臺(tái)和移液器;
? 試劑盒里所有物品應(yīng)視為污染物對(duì)待,并按照《微生物生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室生物安全通則》進(jìn)行處理。
【參考文獻(xiàn)】
[1] 于作. 牛腺病毒3型中國(guó)分離株的鑒定及全基因組序列分析[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院, 2011.
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