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牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)核酸檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)

發(fā)布時(shí)間:2023/3/10      點(diǎn)擊次數(shù):1294

牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)核酸檢測(cè)試劑盒(熒光 PCR 法)

【產(chǎn)品名稱(chēng)】

商品名稱(chēng):牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)核酸檢測(cè)試劑盒(熒光 PCR 法)

Name:  Bovine Viral Diarrhea Virus Detection Kit (Real-Time PCR Method)

【包裝規(guī)格】50T/

【預(yù)期用途】

本試劑盒適用于檢測(cè)的牛的組織樣品、鼻拭子等標(biāo)本中牛病毒性腹瀉病毒核酸,適用于牛病毒性腹瀉病毒   感染的輔助診斷。

【檢驗(yàn)原理】

本試劑盒采用 TaqMan 探針?lè)▽?shí)時(shí)熒光 PCR 技術(shù),設(shè)計(jì)一對(duì)牛病毒性腹瀉病毒特異性引物,結(jié)合一條特異性探針,用熒光 PCR 技術(shù)對(duì)牛病毒性腹瀉病毒的核酸進(jìn)行體外擴(kuò)增檢測(cè),用于臨床上對(duì)可疑感染病料的病原學(xué)診斷。

【試劑組成】

包裝規(guī)格

50T/盒

BVDV 反應(yīng)液

500μL×2 管

酶液

50μL×1 管

BVDV 陽(yáng)性質(zhì)控品

50μL ×1 管

陰性質(zhì)控品

250μL ×1 管

說(shuō)明:不同批號(hào)的試劑盒組分不可交互使用。

【儲(chǔ)存條件及有效期】

-20℃±5℃,避光保存、運(yùn)輸、反復(fù)凍融次數(shù)不超過(guò) 5 次,有效期 12 個(gè)月。

【適用儀器】

ABI7500、安捷倫 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測(cè)儀。

【標(biāo)本采集】

組織樣品:用無(wú)菌剪刀、鑷子采集待檢臟器或組織??刹杉c粘膜刮取物或肺、脾、淋巴結(jié)等作為待檢組織樣品;對(duì)流產(chǎn)胎牛、死胎,直接采集胎兒的組織;對(duì)懷疑死于粘膜病的牛,可采集xue塊或肺、脾、淋巴結(jié)等組織,尤其是腸道集合淋巴組織,如腸道樣品已發(fā)生自溶,可采扁桃體和淋巴結(jié)。將采集的樣品裝入無(wú)菌采樣袋或其他滅菌容器,編號(hào)備用;鼻拭子:對(duì)疑似為急性感染期或持續(xù)感染的牛,采集鼻分泌物拭子。取鼻拭子時(shí)將拭子深入鼻腔來(lái)回擦拭 2 次~3 次并旋轉(zhuǎn),取分泌物;將采樣后的拭子放入盛有 2.0 mL PBS 的采樣管中,編號(hào)備用。

其它樣本采集請(qǐng)參考 GB/T 18637-2018 《牛病毒性腹瀉/粘膜病診斷技術(shù)規(guī)范》。

【保存和運(yùn)輸】

采集或處理好的樣品在 2℃~8℃條件下保存應(yīng)不超過(guò) 24 h;若需長(zhǎng)期保存,應(yīng)放置-70℃以下保存,凍融不超過(guò) 3 次。

【使用方法】

1.  樣品處理(樣本處理區(qū))

1.1  樣本前處理

組織樣品:用無(wú)菌的剪刀和鑷子剪取待檢樣品 2.0g 于研缽或組織勻漿器中充分研磨,再加 10.0mLPBS 混勻,

2000r/min 離心 5 min 后,取 1.0ml 上清液轉(zhuǎn)入無(wú)菌 1.5mL 滅菌離心管中,編號(hào)備用。

鼻拭子:用含 1000U/mL 青霉素和鏈霉素的細(xì)胞培養(yǎng)液 4 倍稀釋后,2000r/min 離心 15min 取上清液,編號(hào)備用。

其他樣本前處理請(qǐng)參考 GB/T 18637-2018 《牛病毒性腹瀉/粘膜病診斷技術(shù)規(guī)范》。

1.2  核酸提取

推薦采用優(yōu)利科(上海)生命科學(xué)有限公司生產(chǎn)的核酸提取或純化試劑(磁珠法或離心柱法)進(jìn)行核酸提取,請(qǐng)按    照試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

2.  試劑配制(試劑準(zhǔn)備區(qū))

根據(jù)待檢測(cè)樣本總數(shù),設(shè)所需要的 PCR 反應(yīng)管管數(shù)為 N(N=樣本數(shù)+1 管陰性對(duì)照+1 管陽(yáng)性對(duì)照;樣品每滿

10 份,多配制 1 份),每測(cè)試反應(yīng)體系配制如下表:

試劑

BVDV 反應(yīng)液

酶液

用量(樣本數(shù)為 N)

19μL

1μL

將混合好的測(cè)試反應(yīng)液分裝到 PCR 反應(yīng)管中,20μL/管。

3.  加樣(樣本處理區(qū))

將步驟 1 提取的核酸、陽(yáng)性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取 5μL,分別加入相應(yīng)的反應(yīng)管中,蓋好管蓋,混勻, 短暫離心。

4.  PCR 擴(kuò)增(核酸擴(kuò)增區(qū))

4.1  將待檢測(cè)反應(yīng)管置于熒光定量 PCR 儀反應(yīng)槽內(nèi);

4.2  設(shè)置好通道、樣品信息,反應(yīng)體系設(shè)置為 25μL;

熒光通道選擇: 檢測(cè)通道(Reporter Dye)FAM, 淬滅通道(Quencher Dye)NONE,ABI 系列儀器請(qǐng)勿選擇

ROX 參比熒光,選擇 None 即可。

4.3  推薦循環(huán)參數(shù)設(shè)置:

步驟

循環(huán)數(shù)

溫度

時(shí)間

收集熒光信號(hào)

1

1 cycle

50℃

10min

2

1 cycle

95℃

2min

3

45 cycles

95℃

15sec

60℃

30sec







5.  結(jié)果分析判定

5.1  結(jié)果分析條件設(shè)定(請(qǐng)參照各儀器使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行設(shè)置,以分析 ABI7500 儀器為例)

反應(yīng)結(jié)束后自動(dòng)保存結(jié)果,根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié) Baseline 的 Start 值、End 值以及 Threshold 值(用戶可根據(jù)實(shí)際情況自行調(diào)整,Start 值可設(shè)在 3~15、End 值可設(shè)在 5~20,使閾值線位于擴(kuò)增曲線指數(shù)期,陰性質(zhì)控品的擴(kuò)增曲線平直或低于閾值線),點(diǎn)擊 Analyze 自動(dòng)獲得分析結(jié)果。

5.2  結(jié)果判斷

陽(yáng)性:檢測(cè)通道 Ct 值≤40,且曲線有明顯的指數(shù)增長(zhǎng)曲線; 陰性:樣本檢測(cè)結(jié)果 Ct 值>40 或無(wú) Ct 值。

5.3  質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)

陰性質(zhì)控品:無(wú)特異性擴(kuò)增曲線或無(wú) Ct 值顯示;

陽(yáng)性質(zhì)控品:擴(kuò)增曲線有明顯指數(shù)增長(zhǎng)期,且 Ct 值≤32; 以上條件應(yīng)同時(shí)滿足,否則實(shí)驗(yàn)視為無(wú)效。

6.  檢測(cè)方法的局限性

1. 樣本檢測(cè)結(jié)果與樣本收集、處理、運(yùn)送以及保存質(zhì)量有關(guān);

2. 樣本提取過(guò)程中沒(méi)有控制好交叉污染,會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果;

3. 陽(yáng)性對(duì)照、擴(kuò)增產(chǎn)物泄漏,會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果;

4. 病原體在流行過(guò)程中基因突變、重組,會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果;

5. 不同的提取方法存在提取效率差異,會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果;

6. 試劑運(yùn)輸,保存不當(dāng)或試劑配制不準(zhǔn)確引起的試劑檢測(cè)效能下降,出現(xiàn)假陰性或定量檢測(cè)不準(zhǔn)確的結(jié)果;

7. 本檢測(cè)結(jié)果僅供參考,如須確診請(qǐng)結(jié)合臨床癥狀以及其他檢測(cè)手段。

【注意事項(xiàng)】

1. 所有操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行;

2. 試劑盒內(nèi)各種組分使用前應(yīng)自然融化,wan全混勻并短暫離心;

3. 反應(yīng)液應(yīng)避光保存;

4. 反應(yīng)中盡量避免氣泡存在,管蓋需蓋緊;

5. 使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)專(zhuān)用工作服;

6. 樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進(jìn)行,以免交叉污染;

7. 實(shí)驗(yàn)完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺(tái)和移液器;

8. 試劑盒里所有物品應(yīng)視為污染物對(duì)待,并按照《微生物生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室生物安全通則》進(jìn)行處理。

【參考文獻(xiàn)】

[1] 中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部(2018).GB/T 18637-2018.國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局;中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì).


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