簡要描述:剛地弓形蟲探針法熒光定量PCR試劑盒剛地弓形蟲(Toxophasma gondii)簡稱弓形蟲,弓漿蟲。寄生于人和許多種動(dòng)物的有核細(xì)胞,引起人畜共患的弓形蟲病。特別是在宿主免疫功能低下時(shí)致病,屬機(jī)會致病原蟲。
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品牌 | YLKBIO | 貨號 | YLK10384P |
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規(guī)格 | 50T | 供貨周期 | 現(xiàn)貨 |
主要用途 | 科研實(shí)驗(yàn) | 應(yīng)用領(lǐng)域 | 化工,生物產(chǎn)業(yè) |
保存條件 | 低溫運(yùn)輸,-20℃保存 | 有效期 | 12個(gè)月 |
試劑盒說明 | 不同批號的試劑盒組分不可交互使用 |
剛地弓形蟲探針法熒光定量PCR試劑盒
產(chǎn)品名稱:剛地弓形蟲探針法熒光定量PCR試劑盒
英文名稱:Toxophasma gondiI Probe qPCR Kit
剛地弓形蟲(Toxophasma gondii)簡稱弓形蟲,弓漿蟲。寄生于人和許多種動(dòng)物的有核細(xì)胞,引起人畜共患的弓形蟲病。特別是在宿主免疫功能低下時(shí)致病,屬機(jī)會致病原蟲。因此快速靈敏檢測剛地弓形蟲有重要意義。本產(chǎn)品就是為此目的根據(jù) PCR 原理開發(fā)的試劑盒,它具有下列特點(diǎn):
1. 即開即用,用戶只需要提供樣品 DNA 模板。
2. 引物和探針經(jīng)過優(yōu)化,靈敏性高。
3. 提供陽性對照,便于區(qū)分假陰性樣品。
4. 特異性高,引物是根據(jù)剛地弓形蟲高度保守區(qū)設(shè)計(jì),不會跟其他微生物 DNA 發(fā)生交叉反應(yīng)。
5. 本產(chǎn)品足夠 50 次 20μL 體系的探針法熒光定量 PCR 反應(yīng)。
6. 本產(chǎn)品只能用于科研。
【試劑組成】
成分 | 包裝 |
2×Probe qPCR MagicMix | 500 μL(本色蓋) |
熒光 PCR 專用模板稀釋液 | 1 mL(黃蓋) |
剛地弓形蟲探針法 qPCR 引物 混合液 | 100 μL(白蓋) |
剛地弓形蟲 qPCR 探針 | 100 μL(棕色管) |
剛地弓形蟲探針法 qPCR 陽性 對照 (1×10E8 拷貝/μL) | 50 μL(黃蓋) |
核酸釋放劑(試用裝) | 20 次(1mL,綠蓋) |
【儲存條件及有效期】
低溫運(yùn)輸,-20℃保存,保存期限為 12 個(gè)月。
【自備試劑】DNA 模板
【使用方法】
一、稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品(以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個(gè) 10 倍稀釋度為例)。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高,因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行,千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分)。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原, 本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照,只提供無傳染性的 DNA 片段作為陽性對照。
1. 標(biāo)記 6 個(gè)離心管,分別為 7,6,5,4,3,2。
2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液,最好用帶芯槍頭, 下同)。
3. 在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供),充分震蕩 1分鐘,得 1×10E7 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
4. 換槍頭,在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得),充分震蕩 1 分鐘,得 1×10E6 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用
5. 換槍頭,在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得),充分震蕩 1 分鐘,得 1×10E5 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
6. 重復(fù)上面的操作直到得到 6 個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
二、樣品 DNA 的制備
7. 如果有 N 個(gè)樣品,最好設(shè)置 N+2 個(gè)提取,多出的一個(gè)是 PC(樣品制備陽性對照),一個(gè)是 NC(樣品制備陰性對照)??梢杂?10μL 陽性對照的 10000 倍稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣,以此作為 PC。另外用水作為 NC。
8. 用自選方法純化樣品的 DNA,本試劑盒跟市場上大多數(shù) DNA/提取試劑盒兼容。本試劑盒免費(fèi)贈(zèng)送 20 次免 DNA 提取的核酸釋放劑,本產(chǎn)品的裂解液可以直接作為 PCR 模板,省略了 DNA 提取步驟。其使用手冊可向本公司客服索取。
三、Probe qPCR 反應(yīng)(20μL 體系,在樣品制備室進(jìn)行)
9. 如果做定量分析并且只做 1 次重復(fù),則標(biāo)記 N+9 個(gè) PCR 管,其中 N+2 個(gè)用于上步得到的 N+2 個(gè)樣品,1 個(gè)用于 PCR 陰性對照(用水做模板),6 個(gè)用于標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果做定性分析,并且只做 1 次重復(fù),則標(biāo)記 N+4 個(gè) PCR 管,其中 N+2 個(gè)用于上步得到的 N+2 個(gè)樣品,1 個(gè)用于 PCR 陰性對照(用水做模板),1 個(gè)用于 PCR 陽性對照(用第 4 號管的陽性對照稀釋液做模板)。下面只以定量分析為例描述操作步驟。
10. 在標(biāo)記管中按下表加入各成分(本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對照設(shè) 置完畢后才設(shè)置陽性對照,并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后最后加):
成分 | 樣品管 N+2 個(gè) | PCR 陰性 對照管 | 標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品管(2-7 管) |
2×Probe qPCR MagicMix | 10 μL | 10 μL | 各 10 μL |
剛地弓形蟲 qPCR 探針 | 1 μL | 1 μL | 各 2 μL |
剛地弓形蟲探針法 qPCR 引物混合液 | 2 μL | 2 μL | 各 2 μL |
N+2 個(gè)待測 DNA 模板 | 6 μL | - | - |
超純水 | - | 6 μL | - |
第 7 步所得標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品稀釋液(2-7 號) | - | - | 各 6μL(2 號樣到 2 號管,3 號 樣到 3 號管…) |
11. 蓋上蓋子后上機(jī),按下面參數(shù)進(jìn)行 PCR:
過程 | 溫度 | 時(shí)間 |
預(yù)變性 | 95℃ | 5 min |
PCR 反應(yīng) (40 個(gè)循環(huán)) | 95℃ | 15sec |
60℃ | 60sec(采集 FAM 通道的熒光 信號) |
四、數(shù)據(jù)處理
12. 如果把本試劑盒用于定量檢測,則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸,以 Ct 值為縱軸,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品 RNA 濃度的 log 值,再推算出其濃度。
13. 如果把本試劑盒用于定性檢測,只判斷陽性或陰性,則陰性對照 Ct 必須大于或等于 40。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長,有典型擴(kuò)增曲線,Ct 值應(yīng)該小于或等于 30。對待測樣品,如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性,如果小于或等于 35 則為陽性。如果在 35-40 之間,則重復(fù)一次。重復(fù)實(shí)驗(yàn)的 Ct 值如果大于或等于 40 則為陰性,如果小于 40,則為陽性。
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