簡要描述:偽狂犬病病毒染料法熒光定量PCR試劑盒偽狂犬病病毒(Pseudorabies Virus,PrV) 會引起偽狂犬病,病豬的臨床癥狀和病程隨年齡不同而有很大差異。
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品牌 | YLKBIO | 貨號 | YLK10371P |
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規(guī)格 | 50T | 供貨周期 | 現(xiàn)貨 |
主要用途 | 科研實驗 | 應(yīng)用領(lǐng)域 | 化工,生物產(chǎn)業(yè) |
英文名稱 | Pseudorabies Virus(PrV) SYBR qPCR Kit | 保存條件 | 低溫運輸,-20℃保存 |
有效期 | 12個月 | 試劑盒說明 | 不同批號的試劑盒組分不可交互使用 |
偽狂犬病病毒染料法熒光定量PCR試劑盒
商品名稱:偽狂犬病病毒染料法熒光定量PCR試劑盒
Name :Pseudorabies Virus(PrV) SYBR qPCR Kit
偽狂犬病病毒(Pseudorabies Virus,PrV) 會引起偽狂犬病,病豬的臨床癥狀和病程隨年齡不同而有很大差異:哺乳仔豬最為敏感,15日齡以內(nèi)的仔豬常表現(xiàn)為最急性型,主要表現(xiàn)為體溫升高、拉稀、發(fā)抖、運動不協(xié)調(diào)、流涎、頸部肌肉僵硬、四肢劃水樣運動,最后昏迷死亡;育肥豬則大多數(shù)伴有體溫升高,呼吸困難,一般不發(fā)生死亡,耐過后呈長朗隱性感染帶毒或排毒;成年豬常不呈現(xiàn)可見臨床癥狀或僅表現(xiàn)為輕微體溫升高,一般不發(fā)生死亡。母豬妊娠初期,可在感染后的20天左右發(fā)生流產(chǎn),在妊娠后期,經(jīng)常發(fā)生死胎和木乃伊,或者產(chǎn)出弱胎和死胎。在完成豬瘟凈化的地區(qū),偽狂犬病被認(rèn)為是對經(jīng)濟影響最大的豬病毒病,因此偽狂犬病病毒的快速準(zhǔn)確鑒定對該病的預(yù)防和檢疫有著重要作用,為此本公司開發(fā)了簡單快捷的偽狂犬病病毒染料法熒光定量PCR檢測試劑盒,
它具有下列特點:
1. 即開即用,用戶只需要提供病毒樣品。
2. 根據(jù)偽狂犬病病毒保守序列設(shè)計的專一性引物,與相關(guān)病毒無交叉反應(yīng)。
3. 靈敏度可以達到幾百拷貝/反應(yīng)。
4. 一管式熒光定量PCR檢測,避免后續(xù)污染。
5. 本試劑盒足夠50次20μL反應(yīng)體系的熒光定量PCR。
6. 本產(chǎn)品只適用于科研,不能用于臨床診斷。
【試劑組成】
成分 | 十孔盒包裝 |
2×qPCR MagicMix | 500μL(棕色管) |
熒光PCR專用模板稀釋液 | 1 mL(黃蓋) |
偽狂犬病病毒PCR引物混合物 | 100μL(白蓋) |
偽狂犬病病毒PCR陽性對照 (1×10E8 拷貝/μL) | 50μL(紅蓋) |
DNA病毒裂解液(試用裝) | 15次(9 mL) |
使用手冊 | 1份 |
【儲存條件及有效期】
低溫運輸、-20℃保存,有效期一年。
【自備試劑】DNA模板、10×ROX(根據(jù)機型決定,具體見使用方法)。
【使用方法】
一、稀釋PCR陽性對照(以10E2-10E7拷貝/μL這6個10倍稀釋度為例)
1. 注意:由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高,因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行,千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分)。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴散傳染性病原,本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照,只提供可以直接使用的DNA片段作為陽性對照。
2. 標(biāo)記6個離心管,分別為7,6,5,4,3,2。
3. 用帶芯槍頭分別加入45 μL熒光PCR專用模板稀釋液(最好用帶芯槍頭,下同)。
4. 在7號管中加入5 μL 1×10E8拷貝/μL 的陽性對照,充分震蕩1分鐘,得1×10E7拷貝/μL的陽性對照。放冰上待用。
5. 換槍頭,在6號管中加入5 μL 1×10E7拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得),充分震蕩1分鐘,得1×10E6拷貝/μL的陽性對照。放冰上待用。
6. 換槍頭,在5號管中加入5 μL 1×10E6拷貝/μL的陽性對照到5號管中,充分震蕩1分鐘,得1×10E5拷貝/μL的陽性對照。放冰上待用。
7. 重復(fù)上面的操作直到得到6個稀釋度的陽性對照。放冰上待用。
樣品DNA的制備
8. 如果有N個樣品,必須設(shè)置N+2個提取,多出的一個是PC(樣品制備陽性對照),一個是NC(樣品制備陰性對照)??梢杂?span>10μL上步制備的PCR陽性對照的第4號(濃度為1×10E4 拷貝/μL,10μL相當(dāng)于1萬拷貝)或第5號(濃度為1×10E5 拷貝/μL,10μL相當(dāng)于10萬拷貝)再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣,以此作為PC。另外用水作為NC。如果每次制備需要200μL樣品,則PC和NC的體積也必須是200μL。
9. 用自選方法純化樣品的DNA,本試劑盒跟市場上大多數(shù)病毒DNA/提取試劑盒兼容。
三、設(shè)置qPCR反應(yīng)(20 μL體系,在樣品制備室進行)
如果只做1次重復(fù),則標(biāo)記N+9個PCR管,其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品,1個用于PCR陰性對
10. 照,6個用于PCR陽性對照。如果做2-3次重復(fù),則反應(yīng)設(shè)置數(shù)量相應(yīng)增加2或3倍。
11. 在標(biāo)記管中按下表加入各成分(本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽性對照,并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后最后加):
成分 | 樣品管 N+2個 | PCR陰性對照管 | PCR陽性 對照管(2-7管) |
2×qPCR MagicMix (棕色管) | 10 μL | 10 μL | 各10 μL |
偽狂犬病病毒PCR 引物混合液(白蓋) | 2 μL | 2 μL | 各2 μL |
自備10×ROX (見注) | 2 μL | 2 μL | 各2 μL |
N+2待測樣品DNA模板 | 6 μL | 不加 | 不加 |
第7步所得PCR陽性對照 稀釋液(2-7號) | 不加 | 不加 | 各6μL(2號樣到2號管,3號樣到3號管…) |
注:僅ABI7500、7700和7900儀器需要使用ROX作為對照,其他熒光PCR儀器(如iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、RotorGene 3000、RotorGene 6000和LightCycler480)不需要使用ROX,則用水替代。
12. 蓋上蓋子后上機,按下面參數(shù)進行PCR(具體PCR參數(shù)可以根據(jù)儀器不同而自行優(yōu)化)。
過程 | 溫度 | 時間 |
預(yù)變性 | 92℃ | 5分鐘 |
PCR反應(yīng) (30個循環(huán)) | 92℃ | 60 秒 |
58℃ | 60 秒 | |
74℃ | 60 秒 |
具體操作按所用儀器推薦的流程進行。本產(chǎn)品中所含的熒光染料在不結(jié)合DNA時,最大吸收光譜在471 nm,結(jié)合DNA時的最大吸收光譜在500 nm,最大發(fā)射光譜在530 nm。信號采集可以設(shè)置在復(fù)性或延伸步驟。
四、數(shù)據(jù)處理
14. 如果把本試劑盒用于定量檢測,則以陽性對照濃度的log值為橫軸,以Ct值為縱軸,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測樣品的Ct值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品DNA濃度的log值,再推算出其濃度。
15. 如果把本試劑盒用于定性檢測,只判斷陽性或陰性,則陰性對照Ct必須大于或等于40。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長,有典型擴增曲線,Ct值應(yīng)該小于或等于30。對待測樣品,如果其Ct大于或等于40則為陰性,如果小于或等于35則為陽性。如果在35-40之間,則重復(fù)一次。重復(fù)實驗的Ct值如果大于或等于40則為陰性,如果小于40,則為陽性。
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