偽狂犬病病毒染料法熒光定量PCR試劑盒

商品名稱：偽狂犬病病毒染料法熒光定量PCR試劑盒

Name     ：Pseudorabies Virus(PrV) SYBR qPCR Kit

偽狂犬病病毒(Pseudorabies Virus，PrV) 會引起偽狂犬病，病豬的臨床癥狀和病程隨年齡不同而有很大差異：哺乳仔豬最為敏感，15日齡以內(nèi)的仔豬常表現(xiàn)為最急性型，主要表現(xiàn)為體溫升高、拉稀、發(fā)抖、運動不協(xié)調(diào)、流涎、頸部肌肉僵硬、四肢劃水樣運動，最后昏迷死亡；育肥豬則大多數(shù)伴有體溫升高，呼吸困難，一般不發(fā)生死亡，耐過后呈長朗隱性感染帶毒或排毒；成年豬常不呈現(xiàn)可見臨床癥狀或僅表現(xiàn)為輕微體溫升高，一般不發(fā)生死亡。母豬妊娠初期，可在感染后的20天左右發(fā)生流產(chǎn)，在妊娠后期，經(jīng)常發(fā)生死胎和木乃伊，或者產(chǎn)出弱胎和死胎。在完成豬瘟凈化的地區(qū)，偽狂犬病被認(rèn)為是對經(jīng)濟影響最大的豬病毒病，因此偽狂犬病病毒的快速準(zhǔn)確鑒定對該病的預(yù)防和檢疫有著重要作用，為此本公司開發(fā)了簡單快捷的偽狂犬病病毒染料法熒光定量PCR檢測試劑盒，

它具有下列特點：

1. 即開即用，用戶只需要提供病毒樣品。

2. 根據(jù)偽狂犬病病毒保守序列設(shè)計的專一性引物，與相關(guān)病毒無交叉反應(yīng)。

3. 靈敏度可以達到幾百拷貝/反應(yīng)。

4. 一管式熒光定量PCR檢測，避免后續(xù)污染。

5. 本試劑盒足夠50次20μL反應(yīng)體系的熒光定量PCR。

6. 本產(chǎn)品只適用于科研，不能用于臨床診斷。

【試劑組成】

【儲存條件及有效期】

低溫運輸、-20℃保存，有效期一年。

【自備試劑】DNA模板、10×ROX（根據(jù)機型決定，具體見使用方法）。

【使用方法】

一、稀釋PCR陽性對照（以10E2-10E7拷貝/μL這6個10倍稀釋度為例）

1.       注意：由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照，只提供可以直接使用的DNA片段作為陽性對照。

2.      標(biāo)記6個離心管，分別為7，6，5，4，3，2。

3.      用帶芯槍頭分別加入45 μL熒光PCR專用模板稀釋液（最好用帶芯槍頭，下同）。

4.      在7號管中加入5 μL 1×10E8拷貝/μL 的陽性對照，充分震蕩1分鐘，得1×10E7拷貝/μL的陽性對照。放冰上待用。

5.      換槍頭，在6號管中加入5 μL 1×10E7拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E6拷貝/μL的陽性對照。放冰上待用。

6.      換槍頭，在5號管中加入5 μL 1×10E6拷貝/μL的陽性對照到5號管中，充分震蕩1分鐘，得1×10E5拷貝/μL的陽性對照。放冰上待用。

7.      重復(fù)上面的操作直到得到6個稀釋度的陽性對照。放冰上待用。

樣品DNA的制備

8.       如果有N個樣品，必須設(shè)置N+2個提取，多出的一個是PC（樣品制備陽性對照），一個是NC（樣品制備陰性對照）?？梢杂?span>10μL上步制備的PCR陽性對照的第4號（濃度為1×10E4 拷貝/μL，10μL相當(dāng)于1萬拷貝）或第5號（濃度為1×10E5 拷貝/μL，10μL相當(dāng)于10萬拷貝）再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為PC。另外用水作為NC。如果每次制備需要200μL樣品，則PC和NC的體積也必須是200μL。

9.      用自選方法純化樣品的DNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù)病毒DNA/提取試劑盒兼容。

三、設(shè)置qPCR反應(yīng)（20 μL體系，在樣品制備室進行）

如果只做1次重復(fù)，則標(biāo)記N+9個PCR管，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1個用于PCR陰性對

10.       照，6個用于PCR陽性對照。如果做2-3次重復(fù)，則反應(yīng)設(shè)置數(shù)量相應(yīng)增加2或3倍。

11.      在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后最后加）：

注:僅ABI7500、7700和7900儀器需要使用ROX作為對照，其他熒光PCR儀器（如iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、RotorGene 3000、RotorGene 6000和LightCycler480）不需要使用ROX，則用水替代。

12.       蓋上蓋子后上機，按下面參數(shù)進行PCR（具體PCR參數(shù)可以根據(jù)儀器不同而自行優(yōu)化）。

具體操作按所用儀器推薦的流程進行。本產(chǎn)品中所含的熒光染料在不結(jié)合DNA時，最大吸收光譜在471 nm，結(jié)合DNA時的最大吸收光譜在500 nm，最大發(fā)射光譜在530 nm。信號采集可以設(shè)置在復(fù)性或延伸步驟。

四、數(shù)據(jù)處理

14.      如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的log值為橫軸，以Ct值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測樣品的Ct值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品DNA濃度的log值，再推算出其濃度。

       15.     如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照Ct必須大于或等于40。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長，有典型擴增曲線，Ct值應(yīng)該小于或等于30。對待測樣品，如果其Ct大于或等于40則為陰性，如果小于或等于35則為陽性。如果在35-40之間，則重復(fù)一次。重復(fù)實驗的Ct值如果大于或等于40則為陰性，如果小于40，則為陽性。