丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量試劑盒說明書
微量法100管/96樣
注 意 :正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定
測定意義:
氧自由基作用于脂質的不飽和脂肪酸,生成過氧化脂質;后者逐漸分解為一系列復雜的化合物,其中包括MDA。通過檢測MDA的水平即可檢測脂質氧化的水平。
測定原理:
MDA與硫代巴bi妥酸(thiobarbituric acid,TBA)縮合,生成紅色產(chǎn)物,在532nm有最大吸收峰,進行比色后可估測樣品中過氧化脂質的含量;同時測定600nm下的吸光度,利用532nm與600nm下的吸光度的差值計算MDA的含量。
需自備的儀器和用品:
可見分光光度計/酶標儀、水浴鍋、臺式離心機、可調式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。
試劑的組成和配置:
提取液:液體100mL×1瓶,4℃保存;
試劑一:液體30mL×1瓶,4℃保存;
注意事項:
臨用前注意試劑一是否wan全溶解,如未溶解,可以70℃-90℃加熱,并振蕩以促進溶解。
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1、細菌、細胞或組織樣品的制備:
細菌或培養(yǎng)細胞:先收集細菌或細胞到離心管內,離心后棄上清;按照細菌或細胞數(shù)量(104個):提取液體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬細菌或細胞加入1mL提取液),超聲波破碎細菌或細胞(冰浴,功率20%或200W,超聲3s,間隔10s,重復30次);8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。
組織:按照組織質量(g):提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液),進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。
2、血清(漿)樣品:直接檢測。
測定步驟:
1、吸取0.3mL 試劑一于1.5mL離心管中,再加入0.1mL樣本, 混勻。
2、95℃水浴中保溫30min(蓋緊,防止水分散失),置于冰浴中冷卻,10000g,25℃,離心10min。
3、吸取200μL上清液于微量石英比色皿或96孔板中,測定532nm和600nm處的吸光度,記為A532和A600,ΔA= A532-A600。
MDA含量計算:
a. 用微量石英比色皿測定的計算公式如下
1、血清(漿)中MDA含量的計算:
MDA含量(nmol/ mL)=[ ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷V樣=25.8×ΔA
2、細菌、細胞或動物組織中MDA含量計算
(1)按照蛋白濃度計算
MDA含量(nmol/ mg prot)=[ ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(Cpr×V樣)=25.8× ΔA ÷Cpr
需要另外測定,建議使用本公司BCA蛋白質含量測定試劑盒。
(2)按照樣品質量計算
MDA含量(nmol/g 鮮重)=[ ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(W ×V樣÷V樣總)=25.8×ΔA ÷W
(3 ) 按照細菌或細胞密度計算:
MDA含量(nmol/104)=[ ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(500×V樣÷V樣總)=0.0516×ΔA
V反總:反應體系總體積, 4×10-4 L;ε:丙二醛摩爾消光系數(shù),155×103 L / mol /cm;d:比色皿光徑,1cm;V樣:加入樣本體積,0.1 mL;V樣總:加入提取液體積,1 mL;Cpr:樣本蛋白質濃度,mg/mL;W:樣本質量,g;500:細胞或細菌總數(shù),500萬。
b.用96孔板測定的計算公式如下
1、血清(漿)中MDA含量的計算:
MDA含量(nmol/ mL)=[ ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷V樣=51.6×ΔA
2、細菌、細胞或動物組織中MDA含量計算
(1)按照蛋白濃度計算
MDA含量(nmol/ mg prot)=[ ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(Cpr×V樣)=51.6×ΔA÷Cpr
需要另外測定,建議使用本公司BCA蛋白質含量測定試劑盒。
(2)按照樣品質量計算
MDA含量(nmol/g 鮮重)=[ ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(W ×V樣÷V樣總)=51.6×ΔA÷W
(3 ) 按照細菌或細胞密度計算:
MDA含量(nmol/104)=[ ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(500×V樣÷V樣總)=0.1032×ΔA
V反總:反應體系總體積,4×10-4 L;ε:丙二醛摩爾消光系數(shù),155×103 L / mol /cm;d:96孔板光徑,0.5cm;V樣:加入樣本體積,0.1 mL;V樣總:加入提取液體積,1 mL;Cpr:樣本蛋白質濃度,mg/mL;W:樣本質量,g;500:細胞或細菌總數(shù),500萬。
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