黃嘌呤氧化酶(xanthione oxidase, XOD)試劑盒說(shuō)明書
微量法100管/96樣
注 意 :正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定
測(cè)定意義:
XOD(EC 1.17.3.2)催化黃嘌呤氧化生成尿酸和超氧陰離子,是活性氧主要來(lái)源之一;同時(shí)也是核苷酸代謝的關(guān)鍵酶之一。XOD主要分布于哺乳動(dòng)物的心,肺,肝臟等組織中,當(dāng)肝功能受損時(shí),XOD大量釋放到血清中,對(duì)肝損害的診斷具有特異性的意義。
測(cè)定原理:
XOD催化黃嘌呤產(chǎn)生尿酸,尿酸在290nm下有特征吸收峰。
需自備的儀器和用品:
紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板(UV板)、研缽、冰和蒸餾水。
試劑組成和配制:
提取液:100mL×1瓶,4℃保存;
試劑一:30mL×1瓶,4℃保存;
試劑二:粉劑×2瓶,4℃保存。
粗酶液提?。?/span>
1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備:
細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞:先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量(104個(gè)):提取液體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液),超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞(冰浴,功率20%或200W,超聲3s,間隔10s,重復(fù)30次);8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測(cè)。
組織:按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液),進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測(cè)。
2、血清(漿)樣品:直接檢測(cè)。
操作步驟:
1、 分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至290nm,蒸餾水調(diào)零。
2、 XOD檢測(cè)工作液的配制:用時(shí)在每瓶試劑二中加入15mL試劑一,充分混勻,待用;現(xiàn)配現(xiàn)用;
3、 測(cè)定前將XOD檢測(cè)工作液在37℃(哺乳動(dòng)物)或25℃(其它物種)水浴10min以上。
4、 準(zhǔn)備96孔UV板一塊(非普通酶標(biāo)板,普通酶標(biāo)板只能透過(guò)可見(jiàn)光,不能透過(guò)紫外光,檢測(cè)波長(zhǎng)小于340nm務(wù)必使用UV板)。
5、在微量石英比色皿或96孔UV板中加入10μL樣本和250μL工作液,立即混勻并計(jì)時(shí),記錄290nm下初始吸光值A1和1min后的吸光值A2。計(jì)算ΔA=A2-A1。
XOD活性計(jì)算:
a.用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下
1、血清(漿)XOD計(jì)算:
單位的定義:每毫升血清(漿)每分鐘催化產(chǎn)生1nmol 尿酸定義為一個(gè)酶活力單位。
XOD(nmol/min/mL)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷V樣÷T=2131×ΔA
2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中XOD計(jì)算:
(1)按樣本蛋白濃度計(jì)算:
單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1nmol 尿酸定義為一個(gè)酶活力單位。
XOD(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(V樣×Cpr)÷T =2131×ΔA÷Cpr
(2)按樣本鮮重計(jì)算:
單位的定義:每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1nmol 尿酸定義為一個(gè)酶活力單位。
XOD(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(W ×V樣÷V樣總)÷T=2131×ΔA÷W
(3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算:
單位的定義:每一萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生1nmol 尿酸定義為一個(gè)酶活力單位。
XOD(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=4.26×ΔA
V反總:反應(yīng)體系總體積,2.6×10-4 L;ε:尿酸摩爾消光系數(shù),1.22×104 L/ mol /cm;d:比色皿光徑,1cm;V樣:加入樣本體積,0.01 mL;V樣總:加入提取液體積,1 mL;T:反應(yīng)時(shí)間,1 min;W:樣本質(zhì)量,g;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;500:細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù),500萬(wàn)。
b.用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下
1、血清(漿)XOD計(jì)算:
單位的定義:每毫升血清(漿)每分鐘催化產(chǎn)生1nmol 尿酸定義為一個(gè)酶活力單位。
XOD(nmol/min/mL)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷V樣÷T=4262×ΔA
2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中XOD計(jì)算:
(1)按樣本蛋白濃度計(jì)算:
單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1nmol 尿酸定義為一個(gè)酶活力單位。
XOD(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(V樣×Cpr)÷T =4262×ΔA÷Cpr
(2)按樣本鮮重計(jì)算:
單位的定義:每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1nmol 尿酸定義為一個(gè)酶活力單位。
XOD(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(W× V樣÷V樣總)÷T =4262×ΔA÷W
(3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算:
單位的定義:每一萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生1nmol 尿酸定義為一個(gè)酶活力單位。
XOD(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=8.52×ΔA
V反總:反應(yīng)體系總體積,2.6×10-4 L;ε:尿酸摩爾消光系數(shù),1.22×104 L / mol /cm;d:96孔板光徑,0.5cm;V樣:加入樣本體積,0.01 mL;V樣總:加入提取液體積,1 mL;T:反應(yīng)時(shí)間,1 min;W:樣本質(zhì)量,g;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;500:細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù),500萬(wàn)。
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