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查爾酮異構(gòu)酶(Chalcone isomerase, CHI)試劑盒說(shuō)明書(shū)

發(fā)布時(shí)間:2023/11/2      點(diǎn)擊次數(shù):329

查爾酮異構(gòu)酶(Chalcone isomerase, CHI)試劑盒說(shuō)明書(shū)

                                          微量法 100/96


   意 :正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定                                     

測(cè)定意義:

查爾酮異構(gòu)酶(Chalcone isomerase, CHI)是第一個(gè)被認(rèn)識(shí)的黃酮類(lèi)化合物合成相關(guān)酶,也是黃酮代謝途徑中的關(guān)鍵酶之一。查爾酮異構(gòu)酶和查爾酮合酶一起構(gòu)成了黃酮類(lèi)化合物生物合成的限速酶。

 

測(cè)定原理:

查爾酮異構(gòu)酶(CHI)催化查爾酮環(huán)化形成 4,5,7-三羥基黃烷酮,通過(guò)測(cè)定381nm下的吸光度變化表示CHI的活性

 

需自備的儀器和用品:

可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水

 

試劑的組成:

提取液:液體100mL×1瓶,4保存;

試劑一:液體25mL×1瓶,4保存;

試劑二:粉劑×1瓶,4保存;用時(shí)加入20mL試劑一充分溶解待用;用不完的試劑4℃保存。

 

粗酶液提?。?/span>

按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)15~10的比例(建議稱(chēng)取約0.1g組織,加入1mL提取液),進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4離心10min,取上清,置冰上待測(cè)。

 

測(cè)定步驟:

1、  分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至381nm,蒸餾水調(diào)零。

2、  樣本測(cè)定表

在微量石英比色皿或96孔板中加入10µL上清液和190µL試劑二,立即混勻并記錄381nm下初始吸光值A137℃保溫30min后的吸光值A2。計(jì)算ΔAA2-A1。

 

CHI活性計(jì)算:

用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

(1) 按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位定義:每mg組織蛋白在每mL反應(yīng)體系中每小時(shí)A381變化0.1為一個(gè)酶活力單位。

CHIU/mg prot)=ΔA×V反總÷V×Cpr÷0.1÷T =400×ΔA÷Cpr

2按樣本鮮重計(jì)算

單位定義:每g組織在每mL反應(yīng)體系中每小時(shí)A381變化0.1為一個(gè)酶活力單位。

CHIU/g 鮮重)=ΔA×V反總÷(W× V÷V樣總)÷0.1÷T =400×ΔA÷W

 

V反總:反應(yīng)體系總體積,0.2mL V樣:加入樣本體積,0.01mL;V樣總:加入提取液體積,1 mL;T:反應(yīng)時(shí)間,0.5h;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量

 

96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

(1) 按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位定義:每mg組織蛋白在每mL反應(yīng)體系中每小時(shí)A381變化0.05為一個(gè)酶活力單位。

CHIU/mg prot)=ΔA×V反總÷V×Cpr÷0.05÷T =800×ΔA÷Cpr

2按樣本鮮重計(jì)算

單位定義:每g組織在每mL反應(yīng)體系中每小時(shí)A381變化0.05為一個(gè)酶活力單位。

CHIU/g 鮮重)=ΔA×V反總÷(W× V÷V樣總)÷0.05÷T =800×ΔA÷W

V反總:反應(yīng)體系總體積,0.2mL; V樣:加入樣本體積,0.01mL;V樣總:加入提取液體積,1 mL;T:反應(yīng)時(shí)間,0.5h;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量。


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