線粒體轉(zhuǎn)氫酶-2(TH-2)試劑盒說明書
微量法100管/96樣
注 意 :正式測定前務(wù)必取2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定
測定意義:
TH位于線粒體的內(nèi)膜上,又稱為線粒體復(fù)合體六,催化NADH+NADP+和NAD++NADPH相互轉(zhuǎn)化,調(diào)節(jié)線粒體NAD(H)和NADP(H)平衡。把逆向反應(yīng)稱為TH-2,催化NADPH和NAD+生成NADP+和NADH。
測定原理:
NADH和NADPH均在340nm有特征吸收,因此TH催化的轉(zhuǎn)氫反應(yīng)不能導(dǎo)致340nm吸光度發(fā)生變化。用人工合成底物3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸(APAD+)替代NAD+,TH-2催化APAD+還原生成APADH,APADH在375nm有特征光吸收,測定375nm光吸收的增加速率,來計算TH-2活性。
需自備的儀器和用品:
可見分光光度計、臺式離心機、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1mL玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。
試劑的組成和配制:
試劑一:液體100mL×1瓶,-20℃保存;
試劑二:液體50mL×1瓶,-20℃保存;
試劑三:液體18mL×1瓶,4℃保存;
試劑四:粉劑×1支,-20℃保存;
試劑五:粉劑×1支,-20℃保存;
樣本的前處理:
組織、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離:
① 準(zhǔn)確稱取0.1g組織或收集500萬細(xì)胞,加入1mL試劑一,用冰浴勻漿器或研缽勻漿。
② 將勻漿600g,4℃離心5min。
③ 棄沉淀,將上清液移至另一離心管中,11000g,4℃離心10min。
④ 上清液即為除去線粒體的胞漿蛋白,可用于測定從線粒體泄漏的TH-2(此步可選做)。
⑤ 步驟④中的沉淀即為線粒體,加入500uL試劑二,超聲波破碎(冰浴,功率20%或200W,超聲3s,間隔10秒,重復(fù)30次),用于TH-2活性測定。
測定步驟:
1、 分光光度計或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長至375nm,蒸餾水調(diào)零。
2、 樣本測定
(1)工作液的配制:臨用前將試劑四、五轉(zhuǎn)移到試劑三中混合溶解,置于37℃(哺乳動物)或25℃(其它物種)水浴5min;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復(fù)凍融。
(2)在微量石英比色皿或96孔板中加入20μL樣本和180μL工作液,混勻,立即記錄375nm處初始吸光值A1和 10min后的吸光值A2,計算ΔA=A2-A1。
TH-2活性計算:
a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下
(1) 按樣本蛋白濃度計算
單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘產(chǎn)生1 nmol APADH定義為一個酶活性單位。
TH-2活性(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(V樣×Cpr)÷T=149×ΔA÷Cpr
(2) 按樣本鮮重計算
單位的定義:每g組織每分鐘產(chǎn)生1 nmol APADH定義為一個酶活性單位。
TH-2活性(nmol/min /g 鮮重)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T=74.5×ΔA÷W
(3) 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算
單位的定義:每1萬個細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘產(chǎn)生1 nmol APADH定義為一個酶活性單位。
TH-2活性(nmol/min /104 cell)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=0.149×ΔA
V反總:反應(yīng)體系總體積,2×10-4 L;ε:APADH摩爾消光系數(shù),6.7×103 L / mol /cm;d:比色皿光徑,1cm;V樣:加入樣本體積,0.02 mL;V樣總:加入提取液體積,0.5mL;T:反應(yīng)時間,10 min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g;500:細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),500萬。
b.用96孔板測定的計算公式如下
(1) 按樣本蛋白濃度計算
單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘產(chǎn)生1 nmol APADH定義為一個酶活性單位。
TH-2活性(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(V樣×Cpr)÷T=298×ΔA÷Cpr
(2) 按樣本鮮重計算
單位的定義:每g組織每分鐘產(chǎn)生1 nmol APADH定義為一個酶活性單位。
TH-2活性(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T=149×ΔA÷W
(3) 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算
單位的定義:每1萬個細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘產(chǎn)生1 nmol APADH定義為一個酶活性單位。
TH-2活性(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=0.298×ΔA
V反總:反應(yīng)體系總體積,2×10-4 L;ε:APADH摩爾消光系數(shù),6.7×103 L / mol /cm;d:96孔板光徑,0.5cm;V樣:加入樣本體積,0.02 mL;V樣總:加入提取液體積,0.5mL;T:反應(yīng)時間,10 min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g;500:細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),500萬。
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