丙酮酸激酶（Pyruvate kinase，PK）試劑盒說(shuō)明書

                                          微量法100管/96樣

注   意 ：正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義：

PK（EC 2.7.1.40）廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，催化糖酵解過(guò)程中的最后一步反應(yīng)，是糖酵解過(guò)程中的主要限速酶之一，也是產(chǎn)生ATP的關(guān)鍵酶之一，因此測(cè)定PK活性具有重要意義。

測(cè)定原理：

PK催化磷酸烯醇式丙酮酸和ADP生成ATP和丙酮酸，乳酸脫氫酶進(jìn)一步催化NADH和丙酮酸生成乳酸和NAD⁺，在340nm下測(cè)定NADH下降速率，即可反映PK活性。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水

試劑的組成和配制：

提取液：100mL×1瓶，4℃保存;

試劑一：液體20mL×1瓶，4℃保存；；

試劑二：粉劑×2瓶，-20℃保存；

試劑三：液體10μL×2支，4℃保存；

樣本的前處理：

1、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

2、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

3、血清（漿）樣品：直接檢測(cè)。

測(cè)定步驟：

1、  分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至340nm，蒸餾水調(diào)零。

2、  樣本測(cè)定

（1）試劑二的配制：臨用前取試劑二一瓶，加入9mL試劑一和1.06mL蒸餾水充分溶解，置于37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）水浴5min；現(xiàn)配現(xiàn)用。

（2）試劑三的配制：臨用前取試劑三一支，加入0.6mL蒸餾水充分溶解待用；現(xiàn)配現(xiàn)用。

（3）在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本、10μL試劑三和180μL試劑二，混勻，立即記錄340nm處20s時(shí)的吸光值A1和 2min20s后的吸光值A2，計(jì)算ΔA=A1-A2。

PK活性計(jì)算：

a.用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

1、血清（漿）中PK活力的計(jì)算:

單位的定義：每毫升血清（漿）每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

PK（nmol/min/mL）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷V樣÷T=1608×ΔA

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中PK活力的計(jì)算:

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

PK（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T=1608×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每g組織每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

PK（nmol/min /g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W× V樣÷V樣總)÷T=1608×ΔA÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位的定義：每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

PK（nmol/min /10⁴ cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=3.216×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積，2×10^-4 L；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.01 mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，2min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬(wàn)。

b. 用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

1、血清（漿）中PK活力的計(jì)算:

單位的定義：每毫升血清（漿）每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

PK（nmol/min /mL）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷V樣÷T=3216×ΔA

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中PK活力的計(jì)算:

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

PK（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T=3216×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每g組織每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

PK（nmol/min /g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W× V樣÷V樣總)÷T=3216×ΔA÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位的定義：每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

PK（nmol/min /10⁴ cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=6.432×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積，2×10^-4 L；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm；d：96孔板光徑，0.5cm；V樣：加入樣本體積，0.01 mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，2min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬(wàn)。