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果糖-6-磷酸激酶(6-phosphofructokinase,PFK)試劑盒說明書

發(fā)布時間:2023/10/24      點擊次數(shù):246

果糖-6-磷酸激酶(6-phosphofructokinase,PFK)試劑盒說明書

                                               微量法100/96

 

 

   正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定

測定意義

PFKEC 2.7.1.11廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細胞中,負責將果糖-6-磷酸和ATP轉(zhuǎn)化為果糖-1,6二磷酸和ADP,是糖酵解過程的關鍵調(diào)節(jié)酶之一。

 

測定原理

PFK催化果糖-6-磷酸和ATP生成果糖-1,6-二磷酸和ADP,丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶進一步依次催化NADH氧化生成NAD+,在340nm下測定NADH下降速率,即可反映PFK活性。

 

需自備的儀器和用品

紫外分光光度計/酶標儀、水浴鍋、臺式離心機、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。

 

試劑的組成和配制

提取液:100mL×1瓶,4保存;

試劑一:液體20mL×1瓶,4保存;

試劑二:粉劑×1瓶,-20保存;

試劑三:粉劑×1支,4保存;

試劑四:液體8μL×1支,4保存;

 

樣本的前處理

1、細菌或培養(yǎng)細胞:先收集細菌或細胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;按照細菌或細胞數(shù)量(104個):提取液體積(mL)為1000~50001的比例(建議2000萬細菌或細胞加入1mL提取液),超聲波破碎細菌或細胞(冰浴,功率20%或200W,超聲3s,間隔10s,重復30次);8000g 4離心10min,取上清,置冰上待測。

2、組織:按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)15~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液),進行冰浴勻漿。8000g 4離心10min,取上清,置冰上待測。

3、血清(漿)樣品:直接檢測。

 

測定步驟

1、  分光光度計或酶標儀預熱30min以上,調(diào)節(jié)波長至340nm,蒸餾水調(diào)零。

2、  樣本測定

1)在試劑二瓶中加入17mL試劑一和1.13mL蒸餾水充分溶解,置于37℃(哺乳動物)或25℃(其它物種)水浴5min;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復凍融;

2)在試劑三中加入1mL蒸餾水充分混勻,冰上放置備用;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復凍融;

3在試劑四中加入1mL蒸餾水充分混勻,冰上放置待用;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復凍

 

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4)在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本、10μL試劑三、10μL試劑四和170μL試劑二,混勻,立即記錄340nm20s時的吸光值A1 10min20s后的吸光值A2,計算ΔA=A1-A2。

注意:不同勻漿組織中PFK活力不一樣,做正式試驗之前請做1-2只預試,若ΔA>0.5,則說明活力太高,必須用提取液稀釋成適當濃度勻漿上清液(計算公式中乘以相應稀釋倍數(shù)),或縮短反應時間至2min5min,使ΔA<0.5,以提高檢測靈敏度。

 

PFK活力單位的計算

a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下

1、血清(漿)PFK活力的計算:

單位的定義:每毫升血清(漿)每分鐘催化1nmol果糖-6-磷酸和1nmolATP轉(zhuǎn)化為1nmol果糖-1,6-二磷酸和1nmol ADP定義為一個酶活力單位。

PFKnmol/min/mL)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷V÷T=321×ΔA

2、組織、細菌或細胞中PFK活力計算:

1)按樣本蛋白濃度計算:

單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘催化1nmol果糖-6-磷酸和1nmolATP轉(zhuǎn)化為1nmol果糖-1,6-二磷酸和1nmol ADP定義為一個酶活力單位。

PFKnmol/min /mg prot)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(V×Cpr) ÷T=321×ΔA÷Cpr

2)按樣本鮮重計算

單位的定義:每g組織每分鐘催化1nmol果糖-6-磷酸和1nmolATP轉(zhuǎn)化為1nmol果糖-1,6-二磷酸和1nmol ADP定義為一個酶活力單位。

PFKnmol/min /g 鮮重)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(W ×V÷V樣總)÷T=321×ΔA÷W

3)按細菌或細胞密度計算

單位的定義:每1萬個細菌或細胞每分鐘催化1nmol果糖-6-磷酸和1nmolATP轉(zhuǎn)化為1nmol果糖-1,6-二磷酸和1nmol ADP定義為一個酶活力單位。

PFKnmol/min /104 cell)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(2000×V÷V樣總)÷T=0.1605×ΔA

V反總:反應體系總體積,2×10-4 L;εNADH摩爾消光系數(shù),6.22×103 L / mol /cmd:比色皿光徑,1cm;V樣:加入樣本體積,0.01 mL;V樣總:加入提取液體積,1 mLT:反應時間,10 min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mLW:樣本質(zhì)量,g;2000:細菌或細胞總數(shù),2000萬。

 

b.96孔板測定的計算公式如下

1、血清(漿)PFK活力的計算:

單位的定義:每毫升血清(漿)每分鐘催化1nmol果糖-6-磷酸和1nmolATP轉(zhuǎn)化為1nmol果糖-1,6-二磷酸和1nmol ADP定義為一個酶活力單位。

PFKnmol/min/mL)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷V÷T=642×ΔA

2、組織、細菌或細胞中PFK活力計算:

1)按樣本蛋白濃度計算:

單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘催化1nmol果糖-6-磷酸和1nmolATP轉(zhuǎn)化為1nmol果糖-1,6-二磷酸和1nmol ADP定義為一個酶活力單位。

PFKnmol/min /mg prot)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(V×Cpr) ÷T=642×ΔA÷Cpr

2)按樣本鮮重計算

單位的定義:每g組織每分鐘催化1nmol果糖-6-磷酸和1nmolATP轉(zhuǎn)化為1nmol果糖-1,6-二磷酸和1nmol

 

ADP定義為一個酶活力單位。

PFKnmol/min /g 鮮重)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(W× V÷V樣總)÷T=642×ΔA÷W

3)按細菌或細胞密度計算

單位的定義:每1萬個細菌或細胞每分鐘催化1nmol果糖-6-磷酸和1nmolATP轉(zhuǎn)化為1nmol果糖-1,6-二磷酸和1nmol ADP定義為一個酶活力單位。

PFKnmol/min /104 cell)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(2000×V÷V樣總)÷T=0.321×ΔA

V反總:反應體系總體積,2×10-4 L;εNADH摩爾消光系數(shù),6.22×103 L / mol /cm;d96孔板光徑,0.5cmV樣:加入樣本體積,0.01 mL;V樣總:加入提取液體積,1 mL;T:反應時間,10 min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g;2000:細菌或細胞總數(shù),2000萬。


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