磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)試劑盒說明書
微量法100管/96樣
注 意:正式測定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定
測定意義:
PEPC(EC 4.1.1.31)廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和細(xì)胞中,是催化磷酸烯醇式丙酮酸與二氧化碳反應(yīng)生成草酰乙酸呈不可逆反應(yīng)的酶,對三羧酸循環(huán)的運(yùn)轉(zhuǎn)起重要調(diào)節(jié)作用。
測定原理:
PEPC催化磷酸烯醇式丙酮酸和CO2生成草酰乙酸和HPO42-,蘋果酸脫氫酶進(jìn)一步催化草酰乙酸和NADH生成蘋果酸和NAD+,在340nm測定NADH減少速率,計(jì)算PEPC活性。
需自備的儀器和用品:
紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。
試劑的組成和配制:
提取液:100mL×1瓶,4℃保存;
試劑一:液體15 mL×1瓶, 4℃保存;
試劑二:粉劑×2瓶,-20℃保存;
試劑三 :原液10μL×1支,4℃保存;
試劑三:稀釋液5mL×1瓶,4℃保存;
樣本的前處理:
1、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞:先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量(104個(gè)):提取液體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液),超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞(冰浴,功率20%或200W,超聲3s,間隔10s,重復(fù)30次);8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。
2、組織:按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液),進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。
3、血清(漿)樣品:直接檢測。
測定步驟和加樣表:
1、 分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長至340nm,蒸餾水調(diào)零。
2、 樣本測定
(1)取試劑二瓶一瓶,加入6mL試劑一和4.2mL蒸餾水充分混勻,置于37℃(哺乳動(dòng)物)或25℃(其它物種)水浴5min;現(xiàn)配現(xiàn)用。
(2)試劑三工作液的配制:將試劑三原液:試劑三稀釋液=1μL:329μL稀釋,混勻,用多少配多少。
(3)在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本、20μL試劑三、170μL試劑二,混勻,立即記錄340nm處20s時(shí)的吸光值A1和5min20s后的吸光值A2,計(jì)算ΔA=A1-A2。
PEPC活性計(jì)算:
a. 用微量石英比色皿測定的計(jì)算公式如下
1、血清(漿)PEPC活力計(jì)算
單位定義:每毫升血清(漿)每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。
PEPC(nmol/min/mL)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷V樣÷T=643×ΔA
2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中PEPC活力計(jì)算
(1)按樣本蛋白濃度計(jì)算
單位定義:每mg組織蛋白每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。
PEPC(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=643×ΔA÷Cpr
(2)按樣本鮮重計(jì)算
單位定義:每g組織每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。
PEPC(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(W ×V樣÷V樣總)÷T=643×ΔA÷W
(3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算:
單位定義:每1萬個(gè)細(xì)胞每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。
PEPC(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=1.286×ΔA
V反總:反應(yīng)體系總體積,2×10-4 L;ε:NADH摩爾消光系數(shù),6.22×103 L / mol /cm;d:比色皿光徑,1cm;V樣:加入樣本體積,0.01 mL;V樣總:加入提取液體積,1 mL;T:反應(yīng)時(shí)間,5 min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g;500:細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),500萬。
b. 用96孔板測定的計(jì)算公式如下
1、血清(漿)PEPC活力計(jì)算
單位定義:每毫升血清(漿)每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。
PEPC(nmol/min/mL)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷V樣÷T=1286×ΔA
2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中PEPC活力計(jì)算
(1)按樣本蛋白濃度計(jì)算
單位定義:每mg組織蛋白每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。
PEPC(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=1286×ΔA÷Cpr
(2)按樣本鮮重計(jì)算
單位定義:每g組織每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。
PEPC(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(W× V樣÷V樣總)÷T=1286×ΔA÷W
(3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算:
單位定義:每1萬個(gè)細(xì)胞每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。
PEPC(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=2.572×ΔA
V反總:反應(yīng)體系總體積,2×10-4 L;ε:NADH摩爾消光系數(shù),6.22×103 L / mol /cm;d:96孔板光徑,0.5cm;V樣:加入樣本體積,0.01 mL;V樣總:加入提取液體積,1 mL;T:反應(yīng)時(shí)間,5 min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g;500:細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),500萬。
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