總多糖含量測(cè)定試劑盒說明書
微量法100管/96樣
注 意 :正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定
測(cè)定意義:
多糖是生物體中廣泛存在的物質(zhì),是一類由醛糖或酮糖通過糖苷鍵連接而成的天然高分子多聚物,它是生物體內(nèi)重要的生物大分子,是維持生命活動(dòng)正常運(yùn)轉(zhuǎn)的基本物質(zhì)之一。
測(cè)定原理:
利用水提醇沉法提取總多糖,苯酚-硫酸法測(cè)定總多糖含量。
需自備的儀器和用品:
酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、96孔板、無水乙醇、濃硫酸、蒸餾水、水浴鍋。
試劑的組成和配制:
試劑一:12mL×1瓶,4℃保存;
試劑二:無水乙醇,自備;
試劑三:濃硫酸,自備。
總多糖提?。?/p>
樣本烘干粉碎,稱取約0.05g樣本,加入1mL水,充分勻漿。100℃水浴提取2h(必須蓋緊蓋子防止水分流失),冷卻后10000g離心10min,取上清。吸取0.2mL上清,慢慢加入0.8mL無水乙醇,混勻后4℃靜置過夜,10000g離心10min,棄上清,沉淀中加入1mL水,充分混勻溶解沉淀。
測(cè)定步驟
1、 酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至490nm。
2、 吸取200µL上清,加入100µL試劑一和0.5mL濃硫酸,混勻后90℃水浴20min,流水冷卻。取200µL加入酶標(biāo)板,于490nm下測(cè)定吸光值A(chǔ)。
總多糖含量計(jì)算:
以葡萄糖作為對(duì)照品,標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定回歸方程為y = 7.981x - 0.0037,R2 = 0.9973,x為葡萄糖含量(mg/mL),y為吸光值。
總多糖含量(μg/g干重)= (A +0.0037)÷7.981×V1÷V2×V3÷W×1000
=626.49×(A+0.0037) ÷W
V1:醇沉后重新溶解后的體積,1mL;V2:進(jìn)行醇沉的體積,0.2mL;V3,提取時(shí)加入水的體積,1mL;W:樣本質(zhì)量,g;1000,mg到μg的換算系數(shù)。
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